Alkoholowa choroba wątroby i mikrobiom jelitowy

Częstość występowania AUD i ALD rośnie, a obciążenie chorobami w różny sposób dotyka mężczyzn i kobiety. Badania wykazały, że częstość występowania AUD i alkoholowej choroby wątroby (ALD) wzrosła znacznie częściej u kobiet niż u mężczyzn w ciągu ostatniej dekady (80% w porównaniu z 30% w przypadku zaburzeń związanych z używaniem alkoholu i 50% w porównaniu z 30% w przypadku ALD). Badania wykazały również, że kobiety w porównaniu z mężczyznami są bardziej podatne na negatywne skutki picia alkoholu. Badania wykazały, że istnieje zmienność wchłaniania, dystrybucji i metabolizmu alkoholu między mężczyznami i kobietami w wyniku czynników hormonalnych, genetycznych i środowiskowych. Podczas gdy kobiety piją mniej niż mężczyźni, kobiety, które mają AUD, są bardziej narażone na ALD, choroby układu krążenia i raka. Istnieją różnice płciowe dotyczące sposobu spożywania alkoholu przez kobiety i mężczyzn, ale istnieją również różnice płciowe dotyczące prawdopodobieństwa abstynencji, przy czym zamężne kobiety mają wyższy wskaźnik nawrotów niż żonaci mężczyźni. Jednak pomimo niedawnych wysiłków różnice płci w nadużywaniu alkoholu i powikłaniach alkoholowych nie zostały jasno wyjaśnione. Istnieje dwukierunkowość między mikrobiomem jelitowym a AUD i ALD. Intensywne spożywanie alkoholu wiąże się ze zmniejszeniem funkcji bariery jelitowej, zwiększeniem translokacji bakteryjnej i zmianą mikrobiomu jelitowego na fenotyp bardziej zapalny. I odwrotnie, ostatnie badania wykazały, że probiotyki są korzystne w ALD, aw niedawnym badaniu klinicznym fazy 1 badacz wykazał, że przeszczep drobnoustrojów kałowych był w stanie znacznie zmniejszyć zaburzenia związane z używaniem alkoholu w męskiej populacji weteranów. W szczególności wykazano, że VSL#3, mieszanka probiotyczna, jest bezpieczna i chroni przed dysfunkcją bariery jelitowej, chorobami wątroby związanymi z alkoholem, a nawet ponowną hospitalizacją. Dlatego istnieje coraz więcej danych sugerujących, że oś mózg-jelita-mikrobiom (BGM) może być ważna w zaburzeniach związanych z używaniem alkoholu i ALD. Jednak do tej pory nie ma badań oceniających rolę osi BGM w różnicach płciowych w zaburzeniach związanych z używaniem alkoholu lub ALD. Różnice w mikrobiomie związane z płcią są związane z innymi chorobami metabolicznymi. Zarówno w modelach ludzkich, jak i zwierzęcych badania wykazały, że skład mikrobiomu jelitowego i skutki mogą się różnić w zależności od płci w zależności od choroby. Na przykład ta grupa badaczy była w stanie wykazać różnicę w osi BGM w zależności od płci w odniesieniu do otyłości i uzależnienia od jedzenia. To, czy istnieje różnica między płciami w osi BGM, która wpływa na progresję choroby i wynik AUD i ALD, będzie kluczowym celem tego badania pilotażowego.

PODEJŚCIE EKSPERYMENTALNE I HARMONOGRAM Badacze postawili hipotezę, że związane z płcią różnice osi BGM w AUD i ALD wyjaśniają różnice w wynikach pacjentów w zależności od płci oraz że zmiany osi BGM mogą zmniejszać nasilenie zaburzeń związanych z używaniem alkoholu i ALD.

Przegląd Celu 1: Wykazanie wyjściowych różnic płciowych w mikrobiomie jelitowym i metatranskryptomie pacjentów z AUD i ALD oraz skorelowanie tych różnic z ciężkością AUD i ALD. Korzystając z pobierania kału i metagenomiki strzelby, badacze zidentyfikują kluczowe markery bakteryjne i sygnatury metatranskryptomu związane z AUD i ALD w porównaniu ze zdrowymi kontrolami. Następnie badacze ustalą, czy te markery są związane z nasileniem AUD i ALD w sposób zależny od płci. Pacjenci będą rekrutowani ze szpitali Santa Monica UCLA i Ronalda Reagana UCLA. Potencjalnie kwalifikujący się pacjenci zostaną zapytani przez swojego dostawcę, czy zespół badawczy może się z nimi skontaktować. Następnie zespół dokona wstępnego przeglądu wykresów, analizując historię medyczną, listę problemów i aktualne notatki pacjentów hospitalizowanych, aby określić, czy pacjent kwalifikuje się na podstawie kryteriów włączenia i wyłączenia.

Pomiar podstawowych charakterystyk AUD i ALD. Oprócz danych demograficznych pacjentów, badacze zbiorą również dane z kwestionariusza, aby ocenić nasilenie ich AUD oraz kliniczne parametry laboratoryjne, aby ocenić ciężkość ich ALD. Aby ocenić nasilenie AUD, badacze wykorzystają kryteria ciężkości DSM-V, wynik AUDIT, ocenę alkoholu na osi czasu (TLFB), skalę jakości życia (QOL) oraz kwestionariusz głodu alkoholowego – krótki formularz (ACQ -SF). Aby ocenić nasilenie ALD pacjenta, zostaną zebrane kliniczne dane laboratoryjne w celu zmierzenia wyniku funkcji dyskryminacyjnej Maddreya, wyniku MELD-Na, wyniku alkoholowego zapalenia wątroby typu Glasgow i wyjściowych transaminaz. Aby ocenić inne choroby współistniejące, zespół poprosi o szpitalną skalę lęku i depresji (HADS). Kryteria DSM-V dotyczące ciężkości, wynik AUDIT, ocena alkoholu na osi czasu (TLFB), skala jakości życia (QOL), kwestionariusz głodu alkoholowego - krótka forma (ACQ-SF) i HADS to kwestionariusze podawane do celów badawczych. W związku z tym kwestionariusz HADS zostanie oceniony w późniejszym terminie. Wynik funkcji dyskryminacyjnej Maddreya, wynik MELD-Na, wynik alkoholowego zapalenia wątroby typu Glasgow i wyjściowe aminotransferaz są oparte na laboratoriach klinicznych i przeglądzie karty medycznej. Pobieranie próbek i sekwencjonowanie mikrobiomu. Podczas hospitalizacji pacjentów zarówno konserwowany etanol, jak i świeży stolec będą zbierane na początku badania wraz z surowicą do przyszłej analizy, podobnie jak w naszych poprzednich pracach. Kał zostanie zebrany do dostarczonego pojemnika, a następnie pacjent weźmie dostarczoną fiolkę parapak zawierającą łyżkę i weźmie małą pełną łyżeczkę i umieści ją w fiolce para pak, która również zawiera 95% etanol. Próbki te będą następnie przechowywane w temperaturze -80oC, a następnie przetwarzane jako pojedyncza partia. DNA zostanie wyekstrahowane z próbek kału za pomocą ubijania kulek w połączeniu z zestawem ZymoBiomics DNA Miniprep (Zymo Research). DNA wyekstrahowane z próbek kału zostanie poddane fragmentacji i oznaczone kodami kreskowymi przy użyciu komercyjnego zestawu (Illumina Nextera Flex). Biblioteki Shotgun zostaną poddane sekwencjonowaniu przy użyciu Illumina NovaSeq 6000 (komórki przepływowe S4) z docelową głębokością 20 milionów sekwencji sparowanych końców na próbkę. Dane sekwencji zostaną następnie wprowadzone do MetaPhlAn2 w celu taksonomicznej identyfikacji gatunków do analizy składu równoważnej z tą wykonywaną z danymi sekwencji 16S rRNA. Dane metagenomiczne shotgun zostaną również wykorzystane do przeprowadzenia analizy mikrobiomu na poziomie szczepu za pomocą algorytmu ConStrains, który identyfikuje polimorfizmy pojedynczych nukleotydów w danych sekwencji metagenomicznych, które można wykorzystać do śledzenia szczepów w próbkach. Ponadto dane metagenomiczne będą przetwarzane w HUMAnN2 w celu adnotacji rodzin genów i identyfikacji mikrobiologicznego źródła tych genów. Obfitość genów bakteryjnych zostanie połączona w ścieżki w oparciu o klasyfikacje KEGG i MetaCyc. Przetwarzanie surowicy: Krew będzie pobierana podczas każdej wizyty badawczej (około 3-5 ml). Krew zostanie odwirowana i pobrana zostanie surowica. Surowica będzie następnie przechowywana w temperaturze -80°C do przyszłego wykorzystania w metabolomice. Pozbawione identyfikacji próbki surowicy zostaną wysłane do firmy Metabolon w celu przetworzenia i analizy metabolitów.

Omówienie Celu 2: Ustalenie, czy wyjściowe różnice między płciami w mikrobiomie jelitowym i metatranskryptomie przewidują ciągłą abstynencję, recydywę lub wyniki związane z ALD. Pacjenci rekrutowani jak powyżej zostaną losowo przydzieleni w stosunku 1:1 do grupy otrzymującej placebo lub VSL#3 przez 6 miesięcy. Podczas badania będą przyjmować jedną tabletkę VSL#3 raz dziennie (112,5 miliarda CFU na kapsułkę) lub pigułkę placebo zawierającą 100 mg cukru raz dziennie. VSL#3 W wieku 3 i 6 miesięcy pacjent wróci na wizytę i ponownie otrzyma te same kwestionariusze i wyniki kliniczne, co podczas wizyty wyjściowej. Pacjent dostarczy również kał odporny na etanol i odeśle go do nas w zaadresowanej do siebie kopercie, a podczas wizyty zostanie pobrana próbka krwi do analizy w przyszłości. Przy każdym pobraniu zostanie pobrane łącznie 3-5 ml krwi. Perspektywiczne wyniki. Oprócz kwestionariusza i wyników wymienionych powyżej, mierzonych po 3 i 6 miesiącach, zespół zbada również odsetek recydywistów, ponownych hospitalizacji z przyczyn związanych z alkoholem, ponownych hospitalizacji z dowolnej przyczyny, śmiertelności i przeszczepów wątroby.

Przegląd Cel 3. Pokazać, jak zmiana mikrobiomu jelitowego może zmniejszyć nasilenie AUD i ALD w sposób zależny od płci. Jak wspomniano powyżej, zrekrutowani pacjenci zostaną losowo przydzieleni w stosunku 1:1 do grupy otrzymującej placebo lub VSL#3 przez 6 miesięcy. Będą przyjmować jedną tabletkę VSL#3 raz dziennie (112,5 miliarda CFU na kapsułkę) lub pigułkę placebo zawierającą 100 mg cukru raz dziennie. Jako probiotyk z wyboru wybrano VSL#3, ponieważ wcześniej opublikowana literatura wykazała jego bezpieczeństwo w ALD, a modele zwierzęce wykazały jego skuteczność przeciwko zapaleniu dysfunkcji bariery jelitowej w modelach AUD i ALD. Na podstawie obliczeń mocy w oparciu o wcześniejsze prace nad VSL#3, badacze ustalili, że potrzeba około 20 pacjentów na grupę, aby określić różnicę (mężczyzna-placebo, mężczyzna-VSL#3, kobieta-placebo, kobieta-VSL#3, ogółem=80). Zarówno pacjent, jak i personel badawczy nie będą świadomi randomizacji pacjenta. Koordynator badania będzie jedyną osobą, która nie jest zaślepiona na randomizację pacjentów, podczas gdy główny badacz i współbadacze będą zaślepieni przez całe badanie, w tym analizę danych. Główne wyniki i drugorzędne wyniki. Kilka wcześniej opublikowanych badań dotyczących VSL#3 nie wykazało żadnych istotnych zdarzeń niepożądanych w porównaniu z placebo. Dlatego głównym wynikiem prospektywnego randomizowanego badania kontrolnego z placebo będą różnice między płciami we wskaźniku abstynencji i odsetku ustąpienia ALD, mierzone za pomocą wyniku funkcji dyskryminacyjnej Maddreya, wyniku MELD-Na, wyniku alkoholowego zapalenia wątroby typu Glasgow i transaminaz. Drugorzędnymi wynikami będą różnice między płciami dotyczące zmian mikrobiomu, spożycia alkoholu, jakości życia i głodu alkoholowego. Pobieranie próbek i sekwencjonowanie mikrobiomu. Podobne pobieranie i sekwencjonowanie mikrobiomu zostanie wykonane, jak wspomniano powyżej. Ale zamiast sekwencjonowania metagenomicznego shotgun, badacze wykonają pełne sekwencjonowanie 16S dla próbek zebranych po 6 miesiącach, aby obniżyć koszty. Pełne sekwencjonowanie 16S jest tańsze, ale jest w stanie zapewnić nam podobne profile szczepów jak sekwencjonowanie metagenomiczne strzelby.