Doença hepática alcoólica e o microbioma intestinal

A prevalência de AUD e ALD está aumentando e a carga da doença está afetando homens e mulheres de maneira diferente. A pesquisa mostrou que a prevalência de AUD e doença hepática alcoólica (ALD) cresceu significativamente mais para mulheres do que para homens na última década (80% vs 30% para transtorno do uso de álcool e 50% vs 30% para ALD). A pesquisa também descobriu que as mulheres, em comparação com os homens, são mais propensas a sucumbir aos efeitos negativos do álcool. Estudos têm mostrado que há variabilidade na absorção, distribuição e metabolismo do álcool entre homens e mulheres, como resultado de fatores hormonais, genéticos e ambientais. Enquanto as mulheres tendem a beber menos do que os homens, as mulheres que têm AUD são mais propensas a ter ALD, doenças cardiovasculares e câncer. Existem diferenças entre os sexos quanto à forma como homens e mulheres consomem álcool, mas também existem diferenças entre os sexos quanto à probabilidade de se absterem, com as mulheres casadas tendo uma taxa de recaída mais alta do que os homens casados. Mas, apesar dos esforços recentes, a disparidade de sexo no abuso de álcool e nas complicações alcoólicas não foi claramente elucidada. Existe uma bidirecionalidade entre o microbioma intestinal e AUD e ALD. O uso pesado de álcool tem sido associado a uma diminuição na função da barreira intestinal, aumento da translocação bacteriana e uma mudança no microbioma intestinal para um fenótipo mais inflamatório. Por outro lado, pesquisas recentes mostraram que os probióticos são benéficos na ALD e, em um recente ensaio clínico de fase 1, o pesquisador mostrou que o transplante microbiano fecal foi capaz de reduzir significativamente o transtorno do uso de álcool em uma população masculina de veteranos. Especificamente, o VSL#3, uma mistura probiótica, demonstrou ser seguro e protetor contra disfunção da barreira intestinal, doença hepática relacionada ao álcool e até mesmo reinternação. Portanto, há dados crescentes que sugerem que o eixo cérebro-intestino-microbioma (BGM) pode ser importante no transtorno do uso de álcool e ALD. No entanto, até o momento, não há estudos examinando o papel do eixo BGM nas diferenças sexuais do transtorno por uso de álcool ou ALD. As diferenças baseadas no sexo no microbioma estão relacionadas a outras doenças metabólicas. Em modelos humanos e animais, estudos mostraram que a composição e os efeitos do microbioma intestinal podem variar entre os sexos com base na doença. Este grupo de investigadores, por exemplo, foi capaz de mostrar uma diferença baseada no sexo no eixo BGM em relação à obesidade e dependência alimentar. Se existe uma diferença de sexo no eixo BGM que afeta a progressão da doença e o resultado de AUD e ALD será o objetivo principal deste estudo piloto.

ABORDAGEM EXPERIMENTAL E LINHA DO TEMPO Os investigadores levantam a hipótese de que as diferenças relacionadas ao sexo do eixo BGM em AUD e ALD explicam a variação no resultado do paciente por sexo e que as alterações do eixo BGM podem diminuir a gravidade do transtorno por uso de álcool e ALD.

Visão geral do Objetivo 1: Demonstrar diferenças sexuais basais no microbioma intestinal e metatranscriptoma de pacientes com AUD e ALD e correlacionar essas diferenças com a gravidade de AUD e ALD. Utilizando coleta fecal e metagenômica shotgun, os investigadores identificarão os principais marcadores bacterianos e assinaturas de metatranscriptoma relacionados a AUD e ALD em comparação com controles saudáveis. Os investigadores determinarão então se esses marcadores estão associados à gravidade de AUD e ALD de maneira relacionada ao sexo. Os pacientes serão recrutados no hospital Santa Monica UCLA e no Ronald Reagan UCLA Hospital. Os pacientes potencialmente elegíveis serão questionados por seus provedores se eles podem ser contatados pela equipe de pesquisa. Posteriormente, a equipe fará uma revisão preliminar do prontuário observando o histórico médico anterior, a lista de problemas e as anotações atuais do paciente internado para determinar se o paciente é elegível com base nos critérios de inclusão e exclusão.

Medição das características básicas de AUD e ALD. Além das informações demográficas do paciente, os investigadores também coletarão dados do questionário para avaliar a gravidade de seu AUD e parâmetros de laboratório clínico para avaliar a gravidade de seu ALD. Para avaliar a gravidade de seu AUD, os investigadores usarão os critérios de gravidade do DSM-V, a pontuação AUDIT, a avaliação de álcool do Timeline Followback (TLFB), a escala de qualidade de vida (QOL) e o formulário curto do questionário de desejo de álcool (ACQ -SF). Para avaliar a gravidade da ALD do paciente, serão coletados dados laboratoriais clínicos para medir a pontuação da função discriminante de Maddrey, a pontuação MELD-Na, a pontuação de hepatite alcoólica de Glasgow e as transaminases basais. Para avaliar outras comorbidades, a equipe solicitará a escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão (HADS). Os critérios de gravidade do DSM-V, o escore AUDIT, a avaliação de álcool Timeline Followback (TLFB), a escala de qualidade de vida (QOL), o questionário de ânsia de álcool - formulário curto (ACQ-SF) e o HADS são questionários administrados para fins de pesquisa. Como tal, o questionário HADS será pontuado em uma data posterior. A pontuação da função discriminante de Maddrey, a pontuação MELD-Na, a pontuação de hepatite alcoólica de Glasgow e as transaminases basais são baseadas em laboratórios clínicos e revisão de prontuários médicos. Coleta de amostras e sequenciamento de microbiomas. Enquanto os pacientes estiverem hospitalizados, tanto as fezes preservadas em etanol quanto as frescas serão coletadas no início do estudo junto com o soro para análises futuras semelhantes aos nossos trabalhos anteriores. As fezes serão coletadas em um recipiente fornecido, o paciente então pegará um frasco para pak fornecido que contém uma colher e pegará uma colher pequena cheia e colocará no frasco para pak que também contém 95% de etanol. Essas amostras serão armazenadas a -80oC e processadas como um único lote. O DNA será extraído de amostras fecais usando batimento de esferas em conjunto com o kit ZymoBiomics DNA Miniprep (Zymo Research). O DNA extraído das amostras fecais será fragmentado e codificado em um kit comercial (Illumina Nextera Flex). As bibliotecas Shotgun passarão por sequenciamento usando um Illumina NovaSeq 6000 (células de fluxo S4) com uma profundidade alvo de 20 milhões de sequências paired-end por amostra. Os dados da sequência serão então inseridos no MetaPhlAn2 para identificação taxonômica das espécies para análise composicional equivalente àquela realizada com os dados da sequência do 16S rRNA. Os dados metagenômicos shotgun também serão usados ​​para realizar análise de microbioma em nível de cepa com o algoritmo ConStrains, que identifica polimorfismos de nucleotídeo único em dados de sequência metagenômica que podem ser usados ​​para rastrear cepas em amostras. Além disso, dados metagenômicos serão processados ​​no HUMAnN2 para anotação de famílias gênicas e identificação da fonte microbiana desses genes. As abundâncias de genes bacterianos serão agregadas em caminhos baseados nas classificações KEGG e MetaCyc. Processamento de soro: O sangue será coletado em cada visita do estudo (cerca de 3-5 ml). O sangue será centrifugado e o soro será coletado. O soro será armazenado a -80C para uso futuro em metabolômica. Amostras de soro não identificadas serão enviadas à Metabolon para processamento e análise de metabólitos.

Visão geral do Objetivo 2: Determinar se as diferenças sexuais de linha de base no microbioma intestinal e no metatranscriptoma predizem abstinência contínua, reincidência ou resultados relacionados a ALD. Os pacientes recrutados conforme acima serão randomizados de forma 1:1 para um placebo ou VSL#3 por 6 meses. Eles tomarão um comprimido de VSL#3 uma vez ao dia enquanto estiverem no estudo (112,5 bilhões de CFU por cápsula) ou um comprimido de placebo com 100 mg de açúcar uma vez ao dia. VSL#3 Aos 3 meses e 6 meses, o paciente retornará para uma consulta e os mesmos questionários e pontuações clínicas da consulta inicial serão obtidos novamente. O paciente também fornecerá fezes preservadas com etanol e as enviará de volta para nós em um envelope pago auto-endereçado, e uma amostra de sangue sérico será coletada na visita para análise futura. Um total de 3-5 ml de sangue será coletado em cada coleta. Resultados prospectivos. Além do questionário e das pontuações listadas acima, medidas aos 3 meses e 6 meses, a equipe também examinará a taxa de reincidência, reinternação por causas relacionadas ao álcool, reinternação por todas as causas, mortalidade e transplante de fígado.

Visão geral Objetivo 3. Mostrar como a alteração do microbioma intestinal pode diminuir a gravidade de AUD e ALD de maneira dependente do sexo. Conforme mencionado acima, os pacientes recrutados serão randomizados de forma 1:1 para placebo ou VSL#3 por 6 meses. Eles tomarão um comprimido de VSL#3 uma vez ao dia (112,5 bilhões de CFU por cápsula) ou um comprimido de placebo com 100 mg de açúcar uma vez ao dia. O VSL#3 foi escolhido como o probiótico de escolha porque a literatura publicada anteriormente mostrou sua segurança na ALD e os modelos animais mostraram que ele é eficaz contra a inflamação da disfunção da barreira intestinal em modelos de AUD e ALD. Por cálculo de poder baseado em trabalhos anteriores sobre VSL#3, os investigadores determinaram que cerca de 20 pacientes serão necessários por grupo para determinar uma diferença (Masculino-Placebo, Masculino-VSL#3, Feminino-Placebo, Feminino-VSL#3, total = 80). Tanto o paciente quanto a equipe do estudo estarão cegos para a randomização do paciente. O coordenador do estudo será a única pessoa que não está cega para a randomização do paciente, enquanto o PI e os co-investigadores estarão cegos durante todo o estudo, incluindo a análise de dados. Resultados Primários e Resultados Secundários. Vários estudos publicados anteriormente sobre VSL#3 não mostraram eventos adversos significativos em comparação com o placebo. Portanto, o resultado primário do estudo prospectivo randomizado placebo-controlado serão as diferenças entre os sexos na taxa de abstinência e na proporção de resolução da ALD, conforme medido pela pontuação da Função Discriminante de Maddrey, pontuação MELD-Na, Pontuação de Hepatite Alcoólica de Glasgow e transaminases. Os resultados secundários serão as diferenças entre os sexos em relação às alterações do microbioma, consumo de álcool, qualidade de vida e desejo por álcool. Coleta de amostras e sequenciamento de microbiomas. Coleta semelhante e sequenciamento de microbioma serão feitos conforme mencionado acima. Mas, em vez do sequenciamento metagenômico shotgun, os investigadores realizarão o sequenciamento 16S completo para as amostras coletadas em 6 meses para reduzir custos. O sequenciamento 16S completo é menos dispendioso, mas é capaz de nos fornecer perfis de cepa semelhantes aos do sequenciamento metagenômico shotgun.