Alkoholické onemocnění jater a střevní mikrobiom

Prevalence AUD a ALD je na vzestupu a zátěž nemocí postihuje muže a ženy rozdílně. Výzkum ukázal, že prevalence AUD a alkoholického onemocnění jater (ALD) vzrostla v posledním desetiletí u žen výrazně více než u mužů (80 % vs. 30 % u poruchy spojené s užíváním alkoholu a 50 % vs. 30 % u ALD). Výzkum také zjistil, že ženy ve srovnání s muži častěji podlehnou negativním účinkům alkoholu. Studie ukázaly, že existuje variabilita v absorpci, distribuci a metabolismu alkoholu mezi muži a ženami v důsledku hormonálních, genetických a environmentálních faktorů. Zatímco ženy mají tendenci pít méně než muži, ženy, které mají AUD, mají větší pravděpodobnost, že budou mít ALD, kardiovaskulární onemocnění a rakovinu. Mezi pohlavími existují rozdíly v tom, jak ženy a muži konzumují alkohol, ale rozdíly mezi pohlavími existují také v tom, jak je pravděpodobné, že budou abstinovat, přičemž vdané ženy mají vyšší míru recidivy než ženatí muži. Ale navzdory nedávnému úsilí nebyly rozdíly mezi pohlavími ve zneužívání alkoholu a alkoholových komplikacích jasně objasněny. Mezi střevním mikrobiomem a AUD a ALD existuje obousměrnost. Nadměrné užívání alkoholu je spojováno se snížením funkce střevní bariéry, zvýšením bakteriální translokace a posunem střevního mikrobiomu k více zánětlivému fenotypu. Naopak nedávný výzkum ukázal, že probiotika jsou prospěšná u ALD a v nedávné klinické studii fáze 1 výzkumník ukázal, že fekální mikrobiální transplantace byla schopna významně snížit poruchu užívání alkoholu u mužské populace veteránů. Konkrétně VSL#3, probiotická směs, se ukázala jako bezpečná a chrání před dysfunkcí střevní bariéry, onemocněním jater souvisejícím s alkoholem a dokonce i před rehospitalizací. Proto přibývají údaje, které naznačují, že osa mozek-střevo-mikrobiom (BGM) může být důležitá při poruše užívání alkoholu a ALD. Dosud však neexistují žádné studie, které by zkoumaly roli osy BGM v rozdílech mezi pohlavími u poruchy užívání alkoholu nebo ALD. Rozdíly v mikrobiomu na základě pohlaví souvisí s jinými metabolickými onemocněními. Na lidských i zvířecích modelech studie ukázaly, že složení a účinky střevního mikrobiomu se mohou lišit mezi pohlavími na základě onemocnění. Tato skupina výzkumníků například dokázala prokázat rozdíl na základě pohlaví v ose BGM ve vztahu k obezitě a závislosti na jídle. Klíčovým účelem této pilotní studie bude, zda existuje rozdíl mezi pohlavími v ose BGM, který ovlivňuje progresi onemocnění a výsledek AUD a ALD.

EXPERIMENTÁLNÍ PŘÍSTUP A ČASOVÁ OSA Vyšetřovatelé předpokládají, že rozdíly v ose BGM u AUD a ALD související s pohlavím vysvětlují variace ve výsledcích pacientů podle pohlaví a že změny osy BGM mohou snížit závažnost poruchy užívání alkoholu a ALD.

Přehled cíle 1: Prokázat výchozí rozdíly mezi pohlavími ve střevním mikrobiomu a metatranskriptomu pacientů s AUD a ALD a uvést tyto rozdíly do vzájemného vztahu k závažnosti AUD a ALD. S využitím fekálního sběru a metagenomiky brokovnice vyšetřovatelé identifikují klíčové bakteriální markery a metatranskriptomové signatury související s AUD a ALD ve srovnání se zdravými kontrolami. Vyšetřovatelé pak určí, zda jsou tyto markery spojeny se závažností AUD a ALD způsobem souvisejícím s pohlavím. Pacienti se budou rekrutovat z nemocnice Santa Monica UCLA a nemocnice Ronalda Reagana UCLA. Potenciálně způsobilí pacienti budou dotázáni svým poskytovatelem, zda je může výzkumný tým kontaktovat. Poté tým provede předběžnou revizi grafu s ohledem na minulou lékařskou anamnézu, seznam problémů a aktuální poznámky k hospitalizaci, aby určil, zda je pacient způsobilý na základě kritérií pro zařazení a vyloučení.

Měření základních charakteristik AUD a ALD. Kromě demografických informací o pacientech budou vyšetřovatelé také shromažďovat údaje z dotazníků k posouzení závažnosti jejich AUD a klinických laboratorních parametrů k posouzení závažnosti jejich ALD. K posouzení závažnosti jejich AUD použijí vyšetřovatelé kritéria DSM-V pro závažnost, skóre AUDIT, hodnocení alkoholu podle časové osy (TLFB), škálu kvality života (QOL) a krátký dotazník o touze po alkoholu (ACQ). -SF). Aby bylo možné posoudit závažnost ALD pacienta, budou shromážděna klinická laboratorní data pro měření skóre diskriminační funkce pacienta, skóre MELD-Na, skóre glasgowské alkoholické hepatitidy a výchozí hodnoty transamináz. K posouzení dalších komorbitit se tým zeptá na stupnici nemocniční úzkosti a deprese (HADS). Kritéria DSM-V pro závažnost, skóre AUDIT, hodnocení alkoholu v časové ose (TLFB), škála kvality života (QOL), dotazník o touze po alkoholu – krátká forma (ACQ-SF) a HADS jsou dotazníky určené pro výzkumné účely. Dotazník HADS jako takový bude bodován později. Skóre diskriminační funkce Maddrey, skóre MELD-Na, skóre glasgowské alkoholické hepatitidy a výchozí hodnoty transamináz jsou založeny na klinických laboratořích a přehledu lékařských tabulek. Odběr vzorků a sekvenování mikrobiomů. Zatímco jsou pacienti hospitalizováni, bude na začátku odebírána jak konzervovaná etanolem, tak čerstvá stolice spolu se sérem pro budoucí analýzu podobnou našim předchozím pracím. Stolice se odebere do připravené nádoby, pacient si poté vezme přiloženou lahvičku para pak, která obsahuje lžičku, nabere plnou malou lžičku a umístí ji do lahvičky para pak, která také obsahuje 95 % etanolu. Tyto vzorky budou poté uloženy při -80oC a následně zpracovány jako jedna dávka. DNA bude extrahována z fekálních vzorků pomocí tepování kuliček ve spojení se sadou ZymoBiomics DNA Miniprep kit (Zymo Research). DNA extrahovaná ze vzorků stolice bude fragmentována a označena čárovým kódem pomocí komerční sady (Illumina Nextera Flex). Knihovny brokovnic projdou sekvenováním pomocí Illumina NovaSeq 6000 (průtokové buňky S4) s cílovou hloubkou 20 milionů sekvencí párových konců na vzorek. Sekvenční data budou poté vložena do MetaPhlAn2 pro taxonomickou identifikaci druhů pro kompoziční analýzu ekvivalentní té, která byla provedena s daty sekvence 16S rRNA. Metagenomická data brokovnice budou také použita k provedení analýzy mikrobiomu na úrovni kmene pomocí algoritmu ConStrains, který identifikuje jednonukleotidové polymorfismy v datech metagenomické sekvence, které lze použít ke sledování kmenů napříč vzorky. Kromě toho budou v HUMAnN2 zpracována metagenomická data pro anotaci genových rodin a identifikaci mikrobiálního zdroje těchto genů. Množství bakteriálních genů bude agregováno do drah na základě klasifikace KEGG a MetaCyc. Zpracování séra: Krev bude odebrána při každé studijní návštěvě (asi 3-5 ml). Krev bude odstředěna a bude odebráno sérum. Sérum pak bude skladováno při -80 C pro budoucí použití pro metabolomiku. Neidentifikované vzorky séra budou odeslány společnosti Metabolon ke zpracování a analýze metabolitů.

Přehled cíle 2: Zjistit, zda výchozí rozdíly mezi pohlavími ve střevním mikrobiomu a metatranskriptomu předpovídají pokračující abstinenci, recidivu nebo výsledky související s ALD. Pacienti vybraní, jak je uvedeno výše, budou randomizováni způsobem 1:1 buď k placebu nebo VSL#3 po dobu 6 měsíců. Během studie budou užívat jednu pilulku VSL#3 jednou denně (112,5 miliard CFU na kapsli) nebo placebo pilulku se 100 mg cukru jednou denně. VSL#3 Po 3 měsících a 6 měsících se pacient vrátí na návštěvu a znovu obdrží stejné dotazníky a klinické skóre jako u jeho výchozí návštěvy. Pacient také poskytne etanolem perzistentní stolici a pošle nám ji zpět v placené obálce s vlastní adresou a při návštěvě bude odebrán vzorek krve séra pro budoucí analýzu. Při každém odběru bude odebráno celkem 3-5 ml krve. Perspektivní výsledky. Kromě dotazníku a výše uvedených skóre měřených po 3 měsících a 6 měsících bude tým také zkoumat míru recidivy, opětovné hospitalizace pro příčiny související s alkoholem, rehospitalizaci ze všech příčin, mortalitu a transplantaci jater.

Přehled Cíl 3. Ukázat, jak může změna střevního mikrobiomu snížit závažnost AUD a ALD způsobem závislým na pohlaví. Jak bylo uvedeno výše, vybraní pacienti budou randomizováni způsobem 1:1 buď k placebu nebo VSL#3 po dobu 6 měsíců. Budou užívat jednu pilulku VSL#3 jednou denně (112,5 miliard CFU na kapsli) nebo placebo pilulku se 100 mg cukru jednou denně. VSL#3 bylo vybráno jako probiotikum volby, protože dříve publikovaná literatura prokázala jeho bezpečnost u ALD a zvířecí modely prokázaly, že je účinný proti zánětu nebo dysfunkci střevní bariéry u modelů AUD a ALD. Výpočtem síly na základě předchozích prací na VSL#3 vědci určili, že ke stanovení rozdílu bude potřeba asi 20 pacientů na skupinu (Muž-Placebo, Muž-VSL#3, Žena-Placebo, Žena-VSL#3, celkem = 80). Pacient i personál studie budou zaslepeni vůči randomizaci pacienta. Koordinátor studie bude jedinou osobou, která není zaslepená vůči randomizaci pacienta, zatímco PI a spoluřešitelé budou zaslepeni po celou dobu studie včetně analýzy dat. Primární výsledky a sekundární výsledky. Několik dříve publikovaných studií s VSL#3 neprokázalo žádné významné nežádoucí účinky ve srovnání s placebem. Primárním výstupem prospektivní randomizované placebem kontrolované studie tedy budou rozdíly mezi pohlavími v míře abstinence a podílu vymizení ALD, měřeno skóre Maddrey's Discriminant Function, skóre MELD-Na, skóre alkoholické hepatitidy Glasgow a transaminázy. Sekundárními výsledky budou rozdíly mezi pohlavími, pokud jde o změny mikrobiomu, konzumaci alkoholu, kvalitu života a touhu po alkoholu. Odběr vzorků a sekvenování mikrobiomů. Provede se podobný sběr a sekvenování mikrobiomu, jak je uvedeno výše. Ale místo metagenomického sekvenování pomocí brokovnice provedou vyšetřovatelé úplné 16S sekvenování vzorků odebraných po 6 měsících, aby se snížily náklady. Úplné sekvenování 16S je levnější, ale dokáže nám poskytnout podobné profily kmenů jako metagenomické sekvenování pomocí brokovnice.