Badanie metagenomiczne w wysięku parapneumonicznym

Wysięk parapneumoniczny (PPE) jest częstym i poważnym problemem klinicznym. Wśród pacjentów cierpiących na pozaszpitalne zapalenie płuc aż u 57% z nich rozwinie się wysięk parapneumoniczny (PPE), au 7,2% rozwinie się powikłany wysięk parapneumoniczny (CPPE) i ropniak. Te dwa ostatnie, zwane łącznie zakażeniem opłucnej, wiążą się z długim pobytem w szpitalu, wysokimi wskaźnikami przyjęć na oddział intensywnej terapii, poważną chorobowością i śmiertelnością.

Podstawą leczenia zakażenia opłucnej jest terminowe podawanie odpowiednich antybiotyków i odpowiedni drenaż płynu opłucnowego. Jednak początkowy wybór antybiotyków jest prawie zawsze empiryczny i można go dostosować dopiero po uzyskaniu pozytywnych wyników mikrobiologicznych płynu opłucnowego lub odpowiednich próbek. Rzeczywiście, niewystarczające zrozumienie lokalnej bakteriologii, schematu lekooporności i brak lokalnych wytycznych dotyczących empirycznego stosowania antybiotyków w przypadku zakażenia opłucnej doprowadziło do heterogenicznego zachowania w zakresie przepisywania antybiotyków, co jest istotnym czynnikiem ryzyka pojawienia się lekooporności (np. występowanie opornego na metycylinę Staphylococcus aureus), powikłania antybiotykoterapii (np. zakażenia Clostridium difficile) oraz niekorzystne rokowania pacjentów.

Konwencjonalna hodowla wysięku opłucnowego została uznana za istotną część algorytmu leczenia, ale ma dwie krytyczne wady, które mogą ograniczać opiekę kliniczną:

1. Długi czas realizacji Chociaż wyniki barwienia metodą Grama są zwykle dostępne w ciągu jednego dnia, ostateczne wyniki posiewów i wzorzec wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe pojawiają się dopiero po pięciu dniach. Jeśli infekcja opłucnej nie zostanie opanowana w oczekiwaniu na wyniki posiewu, lekarze na ślepo zwiększą zakres antybiotykoterapii lub przystąpią do dodatkowych interwencji opłucnowych, których można by uniknąć, gdyby wyniki mikrobiologiczne były dostępne wcześnie. Opóźniony powrót wzorca wrażliwości na leki może prowadzić do początkowego stosowania niezgodnych antybiotyków, co miało miejsce u 17 do 24% pacjentów w dwóch kohortach lokalnych
2. Ujemny wynik posiewu płynu opłucnowego jest powszechny w zakażeniu opłucnej Do 40% płynu opłucnowego w zakażeniu opłucnej nie ujawniło żadnego mikroorganizmu w konwencjonalnej hodowli, z powodu niepowodzenia hodowli organizmów o wysokich wymaganiach i leczenia antybiotykami przed pobraniem próbki płynu opłucnowego. Nasza grupa badawcza stwierdziła, że ​​88% pacjentów z ropniakiem otrzymało antybiotyki empiryczne przed jakąkolwiek interwencją opłucnową, co odzwierciedlało rzeczywistą praktykę. Chociaż zaszczepienie płynu opłucnowego w butelce do posiewu krwi może zwiększyć wydajność posiewu w przypadku zakażenia opłucnej o 20%, w praktyce klinicznej wciąż jest dalekie od zadowalającego. Ponadto obróbka mikrobiologiczna próbek nieuszkodzonych w układzie oddechowym często nie jest pouczająca. Zatem stosowanie antybiotyków przez cały cykl leczenia jest czysto empiryczne u pacjentów z zakażeniem opłucnej z ujemnym posiewem. Aby przezwyciężyć ten problem i często wielodrobnoustrojową naturę infekcji, obecnie zaleca się środki o bardzo szerokim spektrum działania. Wręcz przeciwnie, brak informacji o hodowli bakteryjnej z nieodpowiednim pokryciem antybiotykami wiąże się ze zwiększoną śmiertelnością.

Badania molekularne niezwiązane z hodowlą zostały zastosowane w celu przezwyciężenia niedoskonałości konwencjonalnej hodowli w ostatniej dekadzie, scharakteryzowania spektrum bakterii w infekcji opłucnej i wzorca oporności na antybiotyki w krótkim okresie czasu oraz w celu podjęcia prawidłowych decyzji klinicznych. Sekwencjonowanie multipleksowe PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) z panelem zapalenia płuc jest w stanie zidentyfikować bakterie, które są powszechnie zaangażowane w zapalenie płuc. Jednak etiologia zakażenia opłucnej nie jest całkowicie replikacją pozaszpitalnego zapalenia płuc, a tym samym ogranicza jego użyteczność. Sekwencjonowanie genu 16S rybosomalnego kwasu rybonukleinowego (rRNA) przewyższa konwencjonalną metodę hodowli, identyfikując więcej bakterii, zwłaszcza beztlenowców, w płynie opłucnowym. Zapewnia wydajne i niedrogie rozwiązanie do badań przesiewowych społeczności mikroflory pod kątem próbek klinicznych o niskiej biomasie bakteryjnej i/lub wysokim zanieczyszczeniu genomowym żywiciela. Ma jednak ograniczenia w wykrywaniu mikrobiomu na poziomie gatunku i może wprowadzać błędy PCR, które maskują prawdziwy skład społeczności. Dyrhovden R i wsp. przeprowadzili pierwszą analizę sekwencjonowania metagenomicznego w Norwegii, aby zrozumieć spektrum bakteriologiczne w potwierdzonym ropniaku. Zidentyfikowali 385 wykrytych bakterii, podczas gdy hodowla wykryła 38 (10%), a sekwencjonowanie genu 16S rRNA PCR/Sanger wykryło 87 (23%) u 64 pacjentów z ropniakiem. Odkrycia te potwierdziły wady konwencjonalnej metody hodowli i konieczność szerszego zastosowania antybiotyków w leczeniu infekcji opłucnej. Jednak to badanie metagenomiczne miało charakter retrospektywny, obejmowało tylko pacjentów z ropniakiem i nie odzwierciedlało pełnego spektrum zakażenia opłucnej. Chen i wsp. zastosowali badanie sekwencjonowania metagenomicznego z analizą funkcjonalną i zidentyfikowali dwa odrębne skupiska mikrobiomu w infekcji opłucnej, Staphylococcus aureus jako gatunek rdzeniowy (typ HA-SA) i bardziej zróżnicowaną społeczność drobnoustrojów (typ LA-SA), która różni się od typowy wzorzec bakteriologiczny znaleziony w badaniach w Hongkongu. Zidentyfikowali również rezystom bakterii, w tym oporność na tetracyklinę i beta-laktamy, co jest ważne przy prowadzeniu odpowiedniego schematu antybiotykoterapii w początkowej fazie leczenia. Interpretacja tych dwóch badań była ograniczona, ponieważ autorzy nie skorelowali wyników mikrobiologicznych z wynikami klinicznymi pacjentów. Niedawno Kanellakis i wsp. potwierdzili głównie polidrobnoustrojową naturę zakażenia opłucnej za pomocą analizy sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA, z zróżnicowanym spektrum bakteryjnym. Zidentyfikowali również odrębne spektrum bakteriologiczne w przypadkach wielo- i jednodrobnoustrojowych oraz skorelowali bakteriologię z wynikami klinicznymi.

Biorąc pod uwagę fakt, że mogą istnieć różnice geograficzne w bakteriologii infekcji opłucnej, a poprzednie badania nie przekładały nowoczesnych technologii sekwencjonowania molekularnego na udoskonalenie początkowego stosowania antybiotyków, pożądane jest lokalne badanie prospektywne łączące wyniki laboratoryjne i kliniczne przy użyciu szerszych metod sekwencjonowania metagenomicznego. Postawiliśmy hipotezę, że sekwencjonowanie metagenomiczne amplikonu genu 16S rRNA i strzelby ma wyższy wskaźnik wykrywania bakterii w płynie opłucnowym i identyfikację wzorców oporności na antybiotyki niż konwencjonalna kultura u pacjentów z zakażeniem opłucnej. Wyniki z dwóch metod sekwencjonowania molekularnego uzupełniają się i mogą pomóc w początkowym leczeniu antybiotykami, zminimalizować pojawianie się lekooporności, skorelować spektrum mikrobiologiczne z wynikami klinicznymi i przygotować się do badań na dużą skalę obejmujących całe terytorium poprzez włączenie technologii molekularnej do leczenie infekcji opłucnej. Krótki czas realizacji sprawia, że ​​technologia ta jest również atrakcyjna dla lekarzy i ostatecznie przynosi korzyści pacjentowi poprzez poprawę jakości opieki. Ponieważ wydajność diagnostyczna, wymagania techniczne i koszt dwóch metod sekwencjonowania molekularnego są różne, badanie to dostarczy podstawowych informacji i poprowadzi ich zastosowanie w warunkach klinicznych.

Patogeneza pozaszpitalnego zakażenia opłucnej jest kontrowersyjna. Konwencjonalne przekonanie o przenikaniu bakterii przez miąższ płuc do jamy opłucnej zostało zakwestionowane przez (1) różne spektrum patogenów wywołujących zapalenie płuc i zapalenie opłucnej, (2) brak radiologicznych dowodów zapalenia płuc oraz (3) beztlenowce są często znalezione w posiewach płynu opłucnowego, ale są rzadkie w normalnym miąższu płuc z powodu wysokiego ciśnienia tlenu. Dlatego zrozumienie ostatecznego źródła patogenów i drogi ich wnikania do przestrzeni opłucnej jest kluczowym krokiem w zapobieganiu i leczeniu infekcji opłucnej. Obecnie istnieje bardzo niewiele dowodów na powiązanie mikrobiomu w płynie opłucnowym zakażenia opłucnej oraz w jamie ustnej i przewodzie pokarmowym.

Celem pracy jest scharakteryzowanie pełnego spektrum bakterii wywołujących zapalenie opłucnej i porównanie wydajności diagnostycznej identyfikacji patogenów między kulturą konwencjonalną, amplikonem genu 16S rRNA i sekwencjonowaniem metagenomicznym shotgun. Wzorzec oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe bakterii sprawczych, wyniki kliniczne zakażenia opłucnej zostaną również porównane między grupami skategoryzowanymi według wzorca bakteriologicznego zidentyfikowanego różnymi metodami.