Metagenomická studie parapneumonických výpotků

Parapneumonický výpotek (PPE) je častým a závažným klinickým problémem. Mezi pacienty trpícími komunitní pneumonií by se až u 57 % z nich vyvinul parapneumonický výpotek (PPE) a u 7,2 % by se vyvinul komplikovaný parapneumonický výpotek (CPPE) a empyém. Poslední dvě, souhrnně známé jako pleurální infekce, jsou spojeny s dlouhou hospitalizací, vysokou mírou přijetí na jednotky intenzivní péče, závažnou morbiditou a mortalitou.

Základním kamenem léčby pleurální infekce je včasné podání vhodných antibiotik a adekvátní drenáž pleurální tekutiny. Počáteční volba antibiotik je však téměř vždy empirická a může být upravena pouze po návratu pozitivních mikrobiologických výsledků z pleurální tekutiny nebo relevantních vzorků. Neadekvátní pochopení místní bakteriologie, vzorců lékové rezistence a nedostatek místních pokynů o empirickém pokrytí pleurální infekce antibiotiky vedly k heterogennímu chování antibiotik při předepisování, což je významný rizikový faktor vzniku lékové rezistence (např. výskyt methicilin-rezistentního Staphylococcus aureus), komplikace antibiotické terapie (např. infekce Clostridium difficile) a nepříznivé výsledky u pacientů.

Konvenční kultivace pleurálního výpotku byla považována za nezbytnou součást léčebného algoritmu, ale nese dvě zásadní nevýhody, které mohou omezovat klinickou péči:

1. Dlouhá doba zpracování Přestože výsledky barvení podle Grama mohou být obvykle k dispozici během jednoho dne, konečné výsledky kultivace a vzorec antimikrobiální citlivosti se vrátí až po pěti dnech. V případě, že pleurální infekce není pod kontrolou během čekání na výsledky kultivace, lékaři by slepě zvýšili pokrytí antibiotiky nebo by přistoupili k dalším pleurálním intervencím, kterým se lze vyhnout, pokud jsou mikrobiologické výsledky dostupné včas. Opožděný návrat vzorce citlivosti na léky může vést k počátečnímu použití nesouhlasných antibiotik, k čemuž došlo u 17 až 24 % pacientů ve dvou místních kohortách
2. Negativní kultivace pleurální tekutiny je běžná u pleurální infekce Až 40 % pleurální tekutiny u pleurální infekce nedokázalo odhalit žádný mikroorganismus konvenční kultivací kvůli selhání kultivace náročných organismů a léčbě antibiotiky před odběrem vzorků pleurální tekutiny. Naše studijní skupina zjistila, že 88 % pacientů s empyémem dostávalo empirická antibiotika před jakoukoli pleurální intervencí, což odráží praxi v reálném světě. I když naočkování pleurální tekutiny do lahvičky s hemokulturou může zvýšit výtěžnost kultivace u pleurální infekce o 20 %, v klinické praxi to stále není zdaleka uspokojivé. Navíc mikrobiologické zpracování nerespiračních vzorků často není informativní. Použití antibiotik v průběhu léčby je tedy u pacientů s kultivačně negativní pleurální infekcí čistě empirické. K překonání tohoto problému a často polymikrobiální povahy infekcí jsou v současné době doporučována velmi širokospektrá činidla. Naopak nedostatek informací o bakteriální kultuře s nedostatečným pokrytím antibiotiky byl spojen se zvýšenou úmrtností.

Nekulturní molekulární studie byly použity k překonání nedostatků konvenční kultivace v posledním desetiletí, k charakterizaci spektra bakterií v pleurální infekci a vzoru antibiotické rezistence v krátkém časovém období a informování o správných klinických rozhodnutích. Multiplexní sekvenování PCR (polymerázová řetězová reakce) s panelem pneumonie je schopno identifikovat bakterie, které se běžně účastní pneumonie. Etiologie pleurální infekce však není zcela replikou komunitní pneumonie, a tak omezuje její užitečnost. Sekvenování genu 16S ribozomální ribonukleové kyseliny (rRNA) překonává konvenční kultivační metodu tím, že identifikuje více bakterií, zejména anaerobů, v pleurální tekutině. Poskytuje vysoce výkonné a nákladově efektivní řešení pro screening komunity mikroflóry na klinické vzorky s nízkou bakteriální biomasou a/nebo vysokou kontaminací hostitelského genomu. Má však omezení při detekci mikrobiomu na úrovni druhu a může zavádět předsudky PCR, které maskují skutečné složení komunity. Dyrhovden R et al provedli první metagenomickou sekvenační analýzu v Norsku, aby pochopili spektrum bakteriologie u potvrzeného empyému. Identifikovali 385 bakteriálních detekcí, zatímco kultivace detekovala 38 (10 %) a 16S rRNA gen PCR/Sanger-based sekvenování detekovalo 87 (23 %) u 64 pacientů s empyémem. Tyto nálezy potvrdily nevýhodu konvenční kultivační metody a pro léčbu pleurální infekce je zapotřebí širší pokrytí antibiotiky. Tato metagenomická studie však byla retrospektivní povahy, zahrnovala pouze pacienty s empyémem a neodrážela celé spektrum pleurální infekce. Chen et al použili studii metagenomického sekvenování s funkční analýzou a identifikovali dva odlišné shluky mikrobiomů u pleurální infekce, Staphylococcus aureus jako základní druh (typ HA-SA) a rozmanitější mikrobiální komunitu (typ LA-SA), která se liší od obvyklý bakteriologický vzorec nalezený v hongkongských studiích. Identifikovali také rezistenci bakterií, včetně rezistence na tetracyklin a beta-laktam, což je důležité pro vedení vhodného antibiotického režimu v počáteční fázi léčby. Interpretace těchto dvou studií byla omezená, protože autoři nekorelovali mikrobiologické výsledky s klinickými výsledky pacientů. Kanellakis et al nedávno potvrdili převážně polymikrobiální povahu pleurální infekce pomocí metagenomické sekvenační analýzy 16S rRNA s různorodým bakteriálním spektrem. Identifikovali také odlišné bakteriologické spektrum u polymikrobiálních a monomikrobiálních případů a korelovali bakteriologii s klinickými výsledky.

Vzhledem k tomu, že mohou existovat geografické rozdíly v bakteriologii pleurální infekce a předchozí studie nepřevedly moderní technologie molekulárního sekvenování do upřesnění počátečního použití antibiotik, je žádoucí lokální prospektivní studie propojující laboratorní a klinické nálezy pomocí širších metod metagenomického sekvenování. Předpokládáme, že amplikon genu 16S rRNA a metagenomické sekvenování shotgun mají vyšší míru detekce bakterií v pleurální tekutině a identifikaci vzorů rezistence na antibiotika než konvenční kultivace u pacientů s pleurální infekcí. Výsledky dvou metod molekulárního sekvenování se doplňují a mohou vést k počáteční antibiotické léčbě, minimalizovat vznik lékové rezistence, korelovat mikrobiologické spektrum s klinickými výsledky a připravit se na rozsáhlou celoteritoriální studii začleněním molekulární technologie do léčba pleurální infekce. Krátká doba obrátky také činí tuto technologii atraktivní pro lékaře a v konečném důsledku přináší pacientovi prospěch, protože zlepšuje kvalitu péče. Vzhledem k tomu, že diagnostický výkon, technické požadavky a náklady na dvě metody molekulárního sekvenování jsou různé, tato studie poskytne základní informace a vodítko pro jejich použití v klinických podmínkách.

Patogeneze komunitně získané pleurální infekce je kontroverzní. Konvenční názor na transmigraci bakterií přes plicní parenchym do pleurální dutiny byl zpochybněn (1) odlišným spektrem původců pneumonie a pleurální infekce, (2) absencí radiologických důkazů pneumonie a (3) anaeroby jsou často nacházejí se v kultivaci pleurální tekutiny, ale jsou neobvyklé v normálním plicním parenchymu kvůli vysokému tlaku kyslíku. Porozumění hlavnímu zdroji patogenů a pochopení cesty jejich vstupu do pleurálního prostoru je proto kritickým krokem v prevenci a léčbě pleurální infekce. V současné době existuje velmi omezený důkaz o spojení mikrobioty v pleurální tekutině pleurální infekce a mikrobioty v dutině ústní a gastrointestinálním traktu.

Cílem studie je charakterizovat celé spektrum kauzativních bakterií u pleurální infekce a porovnat diagnostickou výkonnost identifikace patogenů mezi konvenční kultivací, amplikonem genu 16S rRNA a metagenomickým sekvenováním shotgun. Vzorec antimikrobiální rezistence kauzativních bakterií, klinické výsledky pleurální infekce budou také porovnány mezi skupinami, jak jsou kategorizovány podle vzorce bakteriologie identifikovaného různými metodami.