Nowa integracyjna, nieinwazyjna metoda selekcji zarodków do zapłodnienia in vitro oparta na ulepszonej analizie morfokinetycznej sztucznej inteligencji i widmach ramanowskich w zużytych podłożach hodowlanych

Nasze badanie będzie obejmowało dwa etapy. W fazie I (badanie retrospektywne) zostaną zebrane zarchiwizowane dane w celu wyszkolenia metody MK wzmocnionej CNN metodą RS w zakresie selekcji zarodków, co doprowadzi do podejścia zintegrowanego (MK-RS). W fazie II (badanie prospektywne) ustalona zintegrowana metoda MK-RS zostanie wykorzystana do selekcji zarodków, oceny klinicznego wskaźnika ciąż i oceny skuteczności naszego podejścia w randomizowanym badaniu kontrolowanym.

W fazie I obrazy zarodka będą rejestrowane co 10 minut przez wbudowany mikroskop i kamerę w inkubatorze poklatkowym. Obrazy zostaną następnie ocenione przez algorytm CNN w pierwszym dniu segmentacji embrionu ludzkiego w celu zidentyfikowania trzech odrębnych cech: osłonki przejrzystej (ZP), cytoplazmy i przedjądrza (PN). Morfodynamika tych trzech cech podczas zapłodnienia do pierwszego podziału zostanie opakowana jako dane szeregów czasowych do integracji. Zmiany morfologiczne po pierwszym podziale zostaną opatrzone adnotacjami półautomatycznymi, które zostaną przeanalizowane przez komercyjny system punktacji MK (KID Score).

Po usunięciu zarodków/blastocyst z szalki hodowlanej, odpowiednia zużyta pożywka hodowlana (SCM) zostanie zebrana do sterylnych probówek do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Puste pożywki hodowlane będą również zbierane zgodnie z tym samym standardem operacyjnym. Specjalnie zaprojektowany próbnik zostanie użyty do pipetowania 7 μl SCM każdej próbki, przechodzącej przez warstwę olejową SCM, a następnie upuszczenia jej na jednorazowe szkiełko ze szkła kwarcowego i oświetlone przez system RS (Basecare Raman 200, Chiny). Przed badaniem system RS zostanie skalibrowany do 520,5 cm-1 za pomocą płytki krzemowej. Parametry wzbudzenia lasera są ustawione następująco: długość fali 785 nm, moc 320 mW i średnica plamki lasera 100 μm. Sygnały są rejestrowane w trybie standardowym za pomocą kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) z 20-sekundowym czasem całkowania. Dla każdej podwielokrotności zostaną wykonane trzy powtórzenia. Ponowna kalibracja jest niezbędna, gdy testowane są różne podłoża hodowlane, biorąc pod uwagę, że podłoże G-1 jest używane do zarodków przed 3. dniem, a podłoże G-2 do zarodków po 3. dniu. Wszystkie otrzymane widma zostaną wstępnie przetworzone poprzez odjęcie sygnału tła. Sygnały spektroskopowe w obszarze bliskiej podczerwieni (600 cm-1-1800 cm-1) analizuje się pod kątem normalizacji wektorów przy użyciu oprogramowania Labspec 6 (Horiba, Japonia). Nasze poprzednie próbki SCM ze znanymi wynikami ploidalności TE zostaną wykorzystane jako zestaw danych szkoleniowych do ustalenia standardów klasyfikacji euploidów i aneuploidów. Zastosowany zostanie algorytm klasyfikacji stosowej, biorąc pod uwagę jego wysoką ogólną dokładność (95,9%, dane niepublikowane).

Ponieważ segmentowane szeregi czasowe algorytmu CNN, adnotacje KID Score i wyniki profilowania RS mają setki podparametrów, złożymy je razem z uczeniem zespołowym, które traktuje każdy podparametr jako słaby klasyfikator i ponownie przydziela jego wagi podczas treningu. Podstawowym wskaźnikiem szkolenia jest kliniczny wynik ciąży, a dla ostatecznego określenia informacji poniżej MK i RS wzmocnionych CNN wyniki tworzenia blastocysty zostaną wykorzystane jako wskaźnik drugorzędny. Stosunek zbioru treningowego i zestawu testowego będzie wynosił 1:1, aw zbiorze treningowym zostanie przeprowadzona 5-krotna walidacja krzyżowa w celu monitorowania nadmiernego dopasowania.

Faza II będzie obejmowała prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie z pojedynczą ślepą próbą, mające na celu walidację przeszkolonej metody MK-RS do selekcji zarodków. Metabolomiczne profilowanie SCM przy użyciu RS z analizą MK wzmocnioną CNN zostanie wykorzystane do oceny potencjału rozwojowego zarodków wraz z tradycyjnymi ocenami morfologicznymi zarodków. Wyniki potencjału rozwojowego zarodków posłużą do wyboru najlepszej jakości zarodków. Czułość i swoistość zostaną ocenione za pomocą biopsji TE pacjenta lub wyników nieinwazyjnych badań prenatalnych (NIPT), które dodatkowo potwierdzą punktację metody MK-RS, jeśli jest dostępna.

Randomizacja:

W fazie II uczestnicy, którzy spełnią wszystkie kryteria włączenia i wyłączenia oraz wyrażą zgodę na udział w badaniu, zostaną losowo przydzieleni do grupy eksperymentalnej i grupy kontrolnej w stosunku 1 do 1 przy użyciu wygenerowanej komputerowo listy randomizacyjnej. W przypadku grupy eksperymentalnej selekcja zarodków będzie oparta na metodzie MK-RS ustalonej w fazie I, natomiast selekcja zarodków w grupie kontrolnej będzie oparta wyłącznie na tradycyjnych wynikach oceny morfologii zarodków. W tej próbie wszyscy uczestnicy zostaną zaślepieni.