Un nuovo approccio integrativo non invasivo alla selezione degli embrioni per la fecondazione in vitro basato sull'analisi morfocinetica potenziata dall'intelligenza artificiale e sugli spettri Raman nei mezzi di coltura esauriti

Il nostro studio comprenderà due fasi. Nella fase I (uno studio retrospettivo), i dati archiviati saranno raccolti per addestrare il MK potenziato dalla CNN con il metodo RS sulla selezione degli embrioni, portando all'approccio integrato (MK-RS). Nella fase II (uno studio prospettico), il metodo MK-RS integrato stabilito verrà utilizzato per selezionare gli embrioni, valutare il tasso di gravidanza clinica e valutare l'efficacia del nostro approccio in uno studio controllato randomizzato.

Nella fase I, le immagini dell'embrione verranno acquisite ogni 10 minuti dal microscopio e dalla fotocamera incorporati nell'incubatore time-lapse. Le immagini saranno quindi valutate dall'algoritmo CNN per la segmentazione dell'embrione umano del primo giorno per identificare tre caratteristiche distinte: la zona pellucida (ZP), il citoplasma e il pronucleo (PN). La morfodinamica di queste tre caratteristiche durante la fecondazione alla prima divisione sarà racchiusa come dati di serie temporali per l'integrazione. I cambiamenti morfologici dopo la prima divisione saranno annotati semi-auto, che saranno analizzati dal sistema di punteggio MK commerciale (KID Score).

Dopo la rimozione degli embrioni/blastocisti dal piatto di coltura, il corrispondente mezzo di coltura esaurito (SCM) sarà raccolto in tubi sterili di reazione a catena della polimerasi (PCR). Anche i terreni di coltura in bianco saranno raccolti con lo stesso standard operativo. Un campionatore appositamente progettato verrà utilizzato per pipettare 7 μL di SCM di ciascun campione, passando attraverso lo strato di olio dell'SCM, quindi rilasciarlo su un vetrino di quarzo usa e getta e illuminato dal sistema RS (Basecare Raman 200, Cina). Il sistema RS sarà calibrato a 520,5 cm-1 mediante wafer di silicio prima del test. I parametri di eccitazione del laser sono impostati come segue: lunghezza d'onda di 785 nm, potenza di 320 mW e diametro del punto laser di 100 μm. I segnali vengono catturati in modalità standard con una telecamera CCD (chargecoupled device) con un tempo di integrazione di 20 secondi. Verranno effettuate tre repliche per ciascuna aliquota. La ricalibrazione è essenziale quando vengono testati terreni di coltura diversi, considerando che il terreno G-1 viene utilizzato per gli embrioni prima del giorno 3 e il terreno G-2 viene utilizzato per gli embrioni dopo il giorno 3. Tutti gli spettri ottenuti saranno pre-elaborati sottraendo il segnale di fondo. I segnali spettroscopici all'interno della regione del vicino infrarosso (600 cm-1-1800 cm-1) vengono analizzati per la normalizzazione vettoriale utilizzando il software Labspec 6 (Horiba, Giappone). I nostri precedenti campioni SCM con risultati di ploidia TE noti verranno utilizzati come set di dati di addestramento per stabilire standard di classificazione euploide-aneuploide. Verrà adottato l'algoritmo di classificazione dello stacking, considerata la sua elevata accuratezza complessiva (95,9%, dati non pubblicati).

Poiché le serie temporali segmentate dell'algoritmo CNN, le annotazioni del punteggio KID e i risultati del profilo RS hanno centinaia di sottoparametri, li assembleremo insieme all'apprendimento dell'insieme, che considera ogni sottoparametro come un classificatore debole e riallocherà i loro pesi durante l'addestramento. L'indice primario per l'addestramento è l'esito clinico della gravidanza e per l'ultimazione delle informazioni sotto MK e RS potenziate dalla CNN, i risultati della formazione di blastocisti verranno utilizzati come indice secondario. Il rapporto tra il set di addestramento e il set di test sarà 1:1 e nel set di addestramento verrà eseguita una convalida incrociata di 5 volte per monitorare l'overfitting.

La fase II comprenderà uno studio prospettico, in singolo cieco, randomizzato, progettato per convalidare il metodo MK-RS addestrato per la selezione degli embrioni. Il profilo SCM metabolomico utilizzando RS con analisi MK potenziata dalla CNN sarà utilizzato per valutare il potenziale di sviluppo dell'embrione insieme alle tradizionali valutazioni morfologiche dell'embrione. I risultati del potenziale di sviluppo embrionale saranno utilizzati per selezionare la migliore qualità di embrioni. La sensibilità e la specificità saranno valutate utilizzando la biopsia TE del paziente oi risultati del test prenatale non invasivo (NIPT) confermeranno ulteriormente il punteggio del metodo MK-RS, se disponibile.

Randomizzazione:

Nella Fase II, i partecipanti che soddisfano tutti i criteri di inclusione ed esclusione e acconsentono a partecipare allo studio saranno randomizzati in gruppo sperimentale e gruppo di controllo in rapporto 1 a 1 utilizzando un elenco di randomizzazione generato dal computer. Per il gruppo sperimentale, la selezione degli embrioni si baserà sul metodo MK-RS stabilito nella Fase I, mentre la selezione degli embrioni per il gruppo di controllo si baserà esclusivamente sui tradizionali risultati di classificazione della morfologia dell'embrione. Tutti i partecipanti saranno accecati in questa prova.