Wykorzystanie modelu hodowli 3D do krążących komórek nowotworowych w połączeniu z molekularnymi testami biologicznymi u pacjentów z rakiem HNSCC

Co zaskakujące, według danych statystycznych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) w 2008 r. nowotwory były główną przyczyną zgonów na całym świecie, powodując 7,6 miliona zgonów (około 13% wszystkich zgonów). WHO szacuje również, że w 2030 r. na całym świecie będzie 12 milionów zgonów z powodu nowotworów. Co roku w Wielkiej Brytanii u ponad 285 000 osób diagnozuje się nowotwór, a według aktualnych szacunków u więcej niż jednej na trzy osoby w którymś momencie życia zachoruje na nowotwór. Według danych statystycznych Departamentu Zdrowia (Tajwan) na Tajwanie nowotwory są także jedną z głównych przyczyn zgonów tajwańskiego społeczeństwa. Wydatki związane z opieką i terapią nad pacjentem chorym na nowotwór są wysokie i stanowią obciążenie dla rodziny chorych na raka. Stąd nowotwór jest nie tylko ogromnym zagrożeniem dla życia człowieka, ale ma także poważne skutki społeczne i zdrowotne. Walka z nowotworami jest zatem jednym z priorytetowych zadań badań biomedycznych. Rak to ogólne określenie dużej grupy chorób, które mogą dotyczyć dowolnej części ciała. Inne używane terminy to nowotwory złośliwe i nowotwory. Jedną z cech charakterystycznych raka jest szybkie tworzenie się nieprawidłowych komórek, które rosną poza swoje zwykłe granice i które mogą następnie zaatakować sąsiadujące części ciała i rozprzestrzenić się na inne narządy. Proces ten nazywany jest przerzutami. Rak pierwotny to masa nowotworowa występująca w miejscu początkowej przemiany normalnej komórki w komórkę nowotworową. Gdyby wszystkie komórki pozostały w guzie pierwotnym, rak miałby niewielkie znaczenie kliniczne. Wzrost guza powodowałby ucisk na otaczającą tkankę, ale dobrze odgraniczoną masę guza można wyciąć chirurgicznie w prosty i trwały sposób. Niemniej jednak komórki nowotworowe nie zawsze pozostają w pierwotnym miejscu, lecz oddalają się w wyniku jednego z dwóch procesów: (a) inwazji lub przemieszczania się komórek do sąsiedniej przestrzeni zajmowanej przez inne tkanki; oraz (b) przerzuty, czyli rozprzestrzenianie się komórek do obszarów nie sąsiadujących bezpośrednio z guzem pierwotnym, zazwyczaj poprzez krwioobieg, układ limfatyczny lub przestrzeń ciała. Przerzuty zazwyczaj przebiegają w kilku etapach: (c) oddzielenie komórek od guza pierwotnego, (2) penetracja i migracja komórek nowotworowych do naczyń limfatycznych lub naczyń krwionośnych, (3) osadzenie się komórek nowotworowych w naczyniach krwionośnych odległych narządów, (d ) inwazja komórek nowotworowych przez ściany naczyń i do tkanki miejsc wtórnych, (e) wzrost guzów wtórnych w miejscach wtórnych. Przerzuty nowotworowe są główną przyczyną śmiertelności spowodowanej nowotworami.

Krążące komórki nowotworowe (CTC) to rzadkie gatunki komórek obecne we krwi obwodowej, co udokumentowano od 1869 roku. Powszechnie wiadomo, że obecność CTC w układzie krążenia jest powiązana z przerzutami nowotworowymi. Podstawowe badania nad CTC kryją ogromny potencjał w zakresie badania biologicznych spostrzeżeń na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw przerzutów raka, mutacji genów związanych z nowotworem[8] lub odkrywania biomarkerów, co mogłoby zarówno ułatwić, jak i przyspieszyć naukowców w opracowywaniu nowych rozwiązań terapeutycznych dla przyszłej terapii nowotworów . Ponadto uważa się, że CTC w krążeniu krwi są głównie odpowiedzialne za progresję lub nawrót raka, a zatem są oczywistymi celami terapii przeciwnowotworowej. Kilka pojawiających się badań wykazało, że CTC mogą stanowić biopsję nowotworu w czasie rzeczywistym, którą można wykorzystać w opracowywaniu nowych leków i wyborze schematów terapeutycznych, za pomocą których można ustalić odpowiednio farmakodynamikę lub odpowiedź kliniczną CTC na leczenie. W przypadku tej ostatniej użyteczności klinicznej odpowiedzi CTC na chemioterapię (np. wrażliwość lub oporność na leki) nie tylko może służyć do kierowania spersonalizowaną chemioterapią nowotworów, ale także może być klinicznie ważnym wskaźnikiem monitorowania długoterminowej skuteczności terapeutycznej, nawrotu choroby i zmiany właściwości biologicznych CTC w czasie rzeczywistym i nieinwazyjny sposób . Może to dostarczyć informacji predykcyjnych w celu dostosowania schematu terapeutycznego na wszystkich etapach leczenia raka. Jednakże, zgodnie z najlepszą wiedzą badaczy, zastosowanie CTC było ograniczone głównie ze względu na ich rzadkość – przybliżone stężenie 1 CTC na 105-107 komórek jednojądrzastych krwi, a taka rzadkość sprawia, że ​​są one trudne zarówno do wykrycia, jak i izolacji. Co więcej, zrozumienie przez badaczy ich właściwości biologicznych lub chemiczno-fizycznych było ograniczone dostępnością technologii umożliwiających ich wyizolowanie w wystarczającej liczbie. Ilość wyizolowanych CTC jest zbyt niska, aby osiągnąć najniższe limity próbek w wielu szczegółowych eksperymentach molekularnych i funkcjonalnych. Czynniki te wynikające z niskich wskaźników odzysku spowalniają kliniczne zastosowanie CTC. Pomimo ograniczeń obecnych metod izolacji CTC, krążące komórki nowotworowe wykryto w zdecydowanej większości nowotworów nabłonkowych, takich jak rak piersi, prostaty, płuc i okrężnicy. U pacjentów ze zmianami przerzutowymi zwykle wykrywa się CTC we krwi; jednakże zgłaszano je również w przypadku niektórych nowotworów zlokalizowanych. Dlatego w przypadku dalszych szczegółowych badań, charakterystyki CTC i mechanizmu przerzutów odległych, opracowanie niezawodnego, wysokiego współczynnika odzysku przy wysokiej czystości izolowanych CTC jest obecnie największym wyzwaniem i krytycznym.

Medycyna precyzyjna to stosunkowo nowa strategia mająca na celu określenie najlepszej terapii choroby każdego pacjenta w oparciu o charakterystykę genomową guza danego pacjenta i choć podejście to jest niezwykle obiecujące, złożone profile genetyczne i epigenetyczne poszczególnych komórek nowotworowych sprawiły, że podejście to stanowi wyzwanie . Inne podejście do przewidywania odpowiedzi na leczenie polega na bezpośrednim testowaniu komórek nowotworowych pochodzących od pacjentów w ustalonych dwuwymiarowych (2D) modelach w badaniach przesiewowych leków. Niedawne badania przeprowadzone przez Yoshii i współpracowników wykazały, że trójwymiarowe (3D) warunki hodowli mogą lepiej odzwierciedlać warunki wzrostu nowotworu in vivo niż hodowle komórkowe 2D. Aby to zbadać, opracowaliśmy wcześniej trójwymiarowe modele hodowli HNSCC i porównaliśmy je z kulturami 2D i modelami nowotworów in vivo.

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX) są szeroko stosowane w badaniach przesiewowych leków, aby przezwyciężyć ograniczenia badań przesiewowych 2D. Jednak modele PDX mają również pewne ograniczenia; w tym niski wskaźnik wszczepienia nowotworu u nagich myszy, uderzające różnice w farmakokinetyce między dwojgiem ludzi i myszami oraz długi czas wymagany do badań przesiewowych leku (4-8 miesięcy) w PDX. Ostatnio do badań przesiewowych leków i analizy biomarkerów wykorzystano trójwymiarowe modele hodowli komórkowych. Utworzenie linii komórkowych z hodowli 2D nowotworów pochodzących z tkanki pacjenta ma niski wskaźnik powodzenia i tylko wybrane komórki nowotworowe mogą przetrwać w środowisku 2D, co może odzwierciedlać się w zmienionej heterogeniczności guza w stosunku do pierwotnego guza. Ponadto dobrze wiadomo, że długoterminowa kultura może selekcjonować zmiany genetyczne. Ponieważ większość modeli hodowli 3D pochodzących z ustalonych linii komórkowych 2D nie zachowuje pierwotnego fenotypu nowotworu, opracowanie trójwymiarowych hodowli organoidów raka bezpośrednio z tkanki nowotworowej pacjenta, która obejmuje nowotworowe komórki macierzyste, może lepiej odzwierciedlić charakter nowotworu pacjenta niż te pochodzące z komórki pasażowane wcześniej jako hodowle 2D. Chociaż opublikowano metody wytwarzania organoidów rakowych w różnych typach nowotworów, nie podjęto próby utworzenia organoidów nowotworowych HNSCC. Dlatego badacze byli zainteresowani opracowaniem modelu organoidu nowotworowego HNSCC i scharakteryzowaniem jego właściwości oraz porównaniem ich z cechami oryginału.

Metoda sferoidów pochodzących z tkanki nowotworowej (CTOS) to technika ustalania linii organoidów nowotworowych opisana przez Kondo i in. które wykazały wysoce ustalony wskaźnik zachorowań na raka okrężnicy, raka płuc i raka pęcherza moczowego. W tej metodzie uzyskane linie komórkowe hoduje się i utrzymuje jako organoidy. Organoidy mają zdolność utrzymywania tych samych cech histologicznych pierwotnych nowotworów. Ponadto populacja nowotworowych komórek macierzystych jest bardzo podobna w linii pierwotnego guza i organoidów, co wskazuje, że metoda CTOS może odzwierciedlić charakter pierwotnego guza. W tej propozycji badacze próbują ocenić wykonalność ustalenia i scharakteryzowania organoidów HNSCC oraz użyteczność tych linii komórkowych jako modelu do badań przesiewowych i testowania leków.