Utilizzo di un modello di coltura 3D per cellule tumorali circolanti combinato con saggi biologici molecolari in pazienti con cancro HNSCC

Sorprendentemente, secondo i dati statistici dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), il cancro, che ha causato 7,6 milioni di decessi (circa il 13% di tutti i decessi) nel 2008, è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. L’OMS stima inoltre 12 milioni di decessi per cancro in tutto il mondo nel 2030. Ogni anno nel Regno Unito viene diagnosticato un cancro a più di 285.000 persone e la stima attuale è che più di una persona su tre svilupperà una forma di cancro ad un certo punto della propria vita. A Taiwan, secondo i dati statistici del Dipartimento della Salute (Taiwan), il cancro è anche una delle principali cause di morte tra la popolazione taiwanese. La spesa associata alla cura e alla terapia del malato di cancro è elevata e rappresenta un peso per la famiglia del malato di cancro. Pertanto, il cancro non solo rappresenta un’enorme minaccia per la vita umana, ma ha anche un grave impatto sociale e sanitario nazionale. La lotta contro il cancro è quindi uno dei compiti prioritari della ricerca biomedica. Il cancro è un termine generico per un ampio gruppo di malattie che possono colpire qualsiasi parte del corpo. Altri termini utilizzati sono tumori maligni e neoplasie. Una caratteristica distintiva del cancro è la rapida creazione di cellule anormali che crescono oltre i loro confini abituali e che possono quindi invadere parti adiacenti del corpo e diffondersi ad altri organi. Questo processo è denominato metastasi. Un cancro primario è una massa tumorale presente nel sito di conversione iniziale di una cellula normale in una cellula tumorale. Se tutte le cellule rimanessero nel tumore primario, il cancro avrebbe poca importanza clinica. La crescita del tumore produrrebbe pressione sul tessuto circostante, ma la massa tumorale ben definita potrebbe essere asportata chirurgicamente in modo semplice e permanente. Tuttavia, le cellule tumorali non sempre rimangono nel sito primario ma si allontanano mediante uno dei due processi: (a) invasione, ovvero lo spostamento delle cellule nello spazio vicino occupato da altri tessuti; e (b) metastasi, la diffusione di cellule in aree non direttamente adiacenti al tumore primario, solitamente attraverso il flusso sanguigno, il sistema linfatico o lo spazio corporeo. Le metastasi generalmente si verificano in più fasi: (c) distacco delle cellule dal tumore primario, (2) penetrazione e migrazione delle cellule tumorali nei vasi linfatici o nei vasi sanguigni, (3) alloggiamento delle cellule tumorali nei vasi sanguigni di organi distanti, (d ) invasione delle cellule tumorali attraverso le pareti dei vasi e nel tessuto dei siti secondari, (e) crescita di tumori secondari nei siti secondari. Le metastasi tumorali sono una delle principali cause di letalità causata dal cancro.

Le cellule tumorali circolanti (CTC) sono le rare specie cellulari presenti nel sangue periferico documentate dal 1869. È ben noto che la presenza di CTC nel sistema circolatorio è associata alla metastasi del cancro. Gli studi fondamentali sulle CTC hanno un enorme potenziale per sondare le conoscenze biologiche sui meccanismi molecolari alla base delle metastasi del cancro, della mutazione genetica correlata al cancro[8] o della scoperta di biomarcatori, che potrebbero facilitare e accelerare gli scienziati nello sviluppo di nuove soluzioni terapeutiche per la futura cura del cancro . Inoltre, si ritiene che le CTC presenti nella circolazione sanguigna siano le principali responsabili della progressione o della recidiva del cancro e quindi siano ovvi bersagli della terapia antitumorale. Diversi studi emergenti hanno dimostrato che le CTC possono essere una biopsia tumorale in tempo reale che può essere utilizzata nello sviluppo di nuovi farmaci e nella selezione di regimi terapeutici, mediante i quali è possibile stabilire rispettivamente la farmacodinamica o la risposta clinica delle CTC ai trattamenti. Per quest'ultima utilità clinica, le risposte delle CTC alla chemioterapia (ad es. sensibilità o resistenza ai farmaci) non solo può essere utilizzato per guidare la chemioterapia antitumorale personalizzata, ma può anche essere un indicatore clinicamente importante per monitorare l'efficacia terapeutica a lungo termine, la recidiva della malattia e il cambiamento delle caratteristiche biologiche delle CTC in tempo reale e in modo non invasivo . Ciò può fornire informazioni predittive per l’adeguamento dello schema terapeutico durante le fasi della cura del cancro. Tuttavia, per quanto a conoscenza dei ricercatori, l'uso delle CTC è stato limitato principalmente a causa della loro rarità con una concentrazione approssimativa di 1 CTC per 105-107 cellule mononucleari del sangue, e tale natura di rarità rende difficile sia il rilevamento che l'isolamento. Inoltre, la comprensione da parte dei ricercatori delle loro proprietà biologiche o chimico-fisiche è stata limitata dalla disponibilità di tecnologie in grado di isolarli in numero sufficiente. La quantità di CTC isolate è troppo bassa per raggiungere i limiti di campione più bassi di molti esperimenti molecolari e funzionali dettagliati. Questi fattori derivanti dai bassi tassi di recupero rallentano l’uso clinico delle CTC. Nonostante i limiti degli attuali metodi di isolamento delle CTC, le cellule tumorali circolanti sono state rilevate nella stragrande maggioranza dei tumori epiteliali, come quelli al seno, alla prostata, ai polmoni e al colon. I pazienti con lesioni metastatiche tendono ad avere CTC rilevate nel sangue; tuttavia, questi sono stati segnalati anche in alcuni tumori localizzati. Pertanto, per ulteriori ricerche dettagliate, caratteristiche delle CTC e meccanismo di metastasi a distanza, lo sviluppo di un tasso di recupero affidabile ed elevato con elevata purezza delle CTC isolate è attualmente molto impegnativo e critico.

La medicina di precisione è una strategia relativamente nuova per identificare la migliore terapia per la malattia di ciascun paziente, basata sulla caratterizzazione genomica del tumore di un individuo e, sebbene questo approccio sia estremamente promettente, i complessi profili genetici ed epigenetici delle singole cellule tumorali hanno reso questo approccio impegnativo . Un altro approccio per prevedere la risposta al trattamento è stato quello di testare direttamente le cellule tumorali dei pazienti in modelli bidimensionali (2D) consolidati negli studi di screening farmacologico. Studi recenti di Yoshii e colleghi hanno indicato che le condizioni di coltura tridimensionale (3D) possono riflettere maggiormente le condizioni di crescita del tumore in vivo rispetto alle colture cellulari 2D. Per esplorare questo, abbiamo precedentemente stabilito modelli di coltura 3D per HNSCC e confrontati con colture 2D e modelli di tumori in vivo.

Gli xenotrapianti derivati ​​​​da pazienti (PDX) sono stati ampiamente utilizzati per gli studi di screening farmacologico per superare i limiti degli studi di screening 2D. Tuttavia, i modelli PDX presentano anche alcune limitazioni; inclusi bassi tassi di attecchimento del cancro nei topi nudi, notevoli differenze nella farmacocinetica tra due esseri umani e topi e il lungo tempo richiesto per gli studi di screening farmacologico (4-8 mesi) nei PDX. Recentemente, modelli di colture cellulari 3D sono stati utilizzati per studi di screening farmacologico e analisi di biomarcatori. La creazione di linee cellulari da colture 2D di tumori derivati ​​dal tessuto del paziente ha un basso tasso di successo e solo cellule tumorali selezionate possono sopravvivere nell'ambiente 2D, il che può riflettersi in un'eterogeneità alterata del tumore rispetto al tumore originale. Inoltre, è noto che la cultura a lungo termine può selezionare alterazioni genetiche. Poiché la maggior parte dei modelli di colture 3D derivati ​​da linee cellulari 2D consolidate non mantengono il fenotipo tumorale originale, lo sviluppo di colture di organoidi tumorali 3D direttamente dal tessuto tumorale di un paziente che include cellule staminali tumorali, può ricapitolare meglio il carattere del tumore del paziente rispetto a quelli derivati ​​da cellule precedentemente passate come colture 2D. Sebbene esistano metodi pubblicati per generare organoidi tumorali in vari tipi di cancro, non è stata tentata la creazione di organoidi tumorali HNSCC. Pertanto, i ricercatori erano interessati a sviluppare un modello di organoide del cancro HNSCC, a caratterizzarne le proprietà e a confrontarle con le caratteristiche dell'originale.

Il metodo Cancer Tissue-Originated Spheroids (CTOS) è una tecnica per stabilire linee di organoidi tumorali riportate da Kondo et al. che ha mostrato un tasso altamente consolidato di cancro al colon, cancro ai polmoni e cancro alla vescica. In questo metodo, le linee cellulari ottenute vengono coltivate e mantenute come organoidi. Gli organoidi hanno la capacità di mantenere le stesse caratteristiche istologiche dei tumori originali. Inoltre, la popolazione di cellule staminali tumorali è molto simile tra le linee del tumore originale e quelle degli organoidi, indicando che il metodo CTOS può ricapitolare il carattere del tumore originale. In questa proposta, i ricercatori tentano di valutare la fattibilità della creazione e della caratterizzazione degli organoidi HNSCC e l'utilità di queste linee cellulari come modello per lo screening e il test dei farmaci.