Použití 3D kultivačního modelu pro cirkulující nádorové buňky v kombinaci s molekulárními biologickými testy u pacientů s rakovinou HNSCC

Podle statistických údajů Světové zdravotnické organizace (WHO) je rakovina překvapivě celosvětově hlavní příčinou úmrtí, když v roce 2008 zabila 7,6 milionů úmrtí (asi 13 % všech úmrtí). WHO také odhaduje 12 milionů úmrtí na rakovinu po celém světě v roce 2030. Ve Spojeném království je každoročně diagnostikováno více než 285 000 lidí s rakovinou a současný odhad je, že u více než jednoho ze tří lidí se v určité fázi života vyvine nějaká forma rakoviny. Na Tchaj-wanu je rakovina také jednou z hlavních příčin úmrtí u tchajwanské populace podle statistických údajů ministerstva zdravotnictví (Tchaj-wan). Náklady spojené s péčí a terapií pacientů s rakovinou jsou vysoké a představují zátěž pro rodinu pacientů s rakovinou. Rakovina je tedy nejen obrovskou hrozbou pro lidský život, ale má také vážný sociální dopad a národní zdraví. Boj s rakovinou je proto jedním z prioritních úkolů biomedicínského výzkumu. Rakovina je obecný termín pro velkou skupinu nemocí, které mohou postihnout kteroukoli část těla. Dalšími používanými termíny jsou zhoubné nádory a novotvary. Jedním z definujících rysů rakoviny je rychlá tvorba abnormálních buněk, které rostou za jejich obvyklé hranice a které pak mohou napadnout přilehlé části těla a rozšířit se do dalších orgánů. Tento proces se nazývá metastáza. Primární rakovina je nádorová hmota přítomná v místě počáteční konverze normální buňky na nádorovou buňku. Pokud by všechny buňky zůstaly v primárním nádoru, rakovina by měla malý klinický význam. Růst nádoru by vytvářel tlak na okolní tkáň, ale dobře definovaná nádorová hmota by mohla být vyříznuta chirurgickým zákrokem přímým a trvalým způsobem. Nicméně nádorové buňky nezůstávají vždy na primárním místě, ale pohybují se pryč jedním ze dvou procesů: (a) invazí nebo přesunem buněk do sousedního prostoru obsazeného jinými tkáněmi; a (b) metastázy, šíření buněk do oblastí, které přímo nesousedí s primárním nádorem, obvykle krevním řečištěm, lymfatickým systémem nebo tělesným prostorem. Metastázy se obecně vyskytují v několika fázích: (c) oddělení buněk od primárního nádoru, (2) penetrace a migrace nádorových buněk do lymfatických cév nebo krevních cév, (3) uložení nádorových buněk v krevních cévách vzdálených orgánů, (d ) invaze nádorových buněk stěnami cév a do tkáně sekundárních míst, (e) růst sekundárních nádorů na sekundárních místech. Rakovinové metastázy jsou hlavní příčinou úmrtnosti způsobené rakovinou.

Cirkulující nádorové buňky (CTC) jsou vzácným buněčným druhem přítomným v periferní krvi, který je dokumentován od roku 1869. Je dobře známo, že přítomnost CTC v oběhovém systému je spojena s metastázami rakoviny. Základní studie CTC mají obrovský potenciál pro zkoumání biologických poznatků o molekulárních mechanismech, které jsou základem metastáz rakoviny, genových mutací souvisejících s rakovinou[8] nebo objevu biomarkerů, což by mohlo vědcům usnadnit a urychlit vývoj nových terapeutických řešení pro budoucí onkologickou péči. . Kromě toho se předpokládá, že CTC v krevním oběhu jsou zodpovědné hlavně za progresi nebo relaps rakoviny, a jsou tedy zjevnými cíli terapie rakoviny. Několik nově vznikajících studií ukázalo, že CTC mohou být nádorovou biopsií v reálném čase, kterou lze využít při vývoji nových léků a výběru terapeutických režimů, pomocí kterých lze stanovit farmakodynamiku nebo klinickou odpověď CTC na léčbu. Pro posledně jmenovanou klinickou užitečnost jsou odpovědi CTC na chemoterapii (např. citlivost nebo rezistence na léky) může být nejen použit k vedení personalizované chemoterapie rakoviny, ale může být také klinicky důležitým ukazatelem pro sledování dlouhodobé terapeutické účinnosti, recidivy onemocnění a změny biologických charakteristik CTC v reálném čase a neinvazivním způsobem . To může poskytnout prediktivní informace pro úpravu terapeutického schématu ve všech fázích onkologické péče. Nicméně podle nejlepšího vědomí výzkumníků bylo použití CTC omezeno především kvůli jejich vzácnosti s přibližnou koncentrací 1 CTC na 105 -107 krevních mononukleárních buněk a taková vzácnost ztěžuje jak detekci, tak izolaci. Navíc pochopení jejich biologických nebo chemicko-fyzikálních vlastností ze strany výzkumníků bylo omezeno dostupností technologií schopných je izolovat v dostatečném počtu. Množství izolovaných CTC je příliš nízké na to, aby dosáhlo nejnižších limitů vzorků mnoha podrobných molekulárních a funkčních experimentů. Tyto faktory vyplývající z nízké míry zotavení zpomalují klinické použití CTC. Navzdory omezením současných metod izolace CTC byly cirkulující rakovinné buňky detekovány u velké většiny epiteliálních rakovin, jako je rakovina prsu, prostaty, plic a tlustého střeva. Pacienti s metastatickými lézemi mají tendenci mít CTC detekce v krvi; tyto však byly také hlášeny u některých lokalizovaných rakovin. Pro další podrobné výzkumy, charakteristiky CTC a mechanismu vzdálených metastáz je proto v současné době nejnáročnější a nejkritičtější vyvinout spolehlivou, vysokou míru výtěžnosti s vysokou čistotou izolovaných CTC.

Precizní medicína je relativně nová strategie k identifikaci nejlepší terapie pro onemocnění každého pacienta, založená na genomové charakterizaci nádoru jednotlivce, a i když je tento přístup nesmírně slibný, komplexní genetické a epigenetické profily jednotlivých nádorových buněk činí tento přístup náročným. . Dalším přístupem k predikci léčebné odpovědi bylo přímé testování nádorových buněk od pacientů na zavedených dvourozměrných (2D) modelech ve studiích screeningu léků. Nedávné studie Yoshii a kolegů ukázaly, že trojrozměrné (3D) kultivační podmínky mohou více odrážet podmínky růstu nádoru in vivo než 2D buněčné kultury. Abychom to prozkoumali, dříve jsme vytvořili 3D kultivační modely pro HNSCC a porovnali je s 2D kulturami a modely nádorů in vivo.

Xenoimplantáty odvozené od pacientů (PDX) byly široce používány pro screeningové studie léků k překonání omezení 2D screeningových studií. Modely PDX však mají také určitá omezení; včetně nízké míry přihojení rakoviny u nahých myší, nápadných rozdílů ve farmakokinetice mezi dvěma lidmi a myšmi a dlouhého času potřebného pro studie screeningu léků (4-8 měsíců) u PDX. Nedávno byly 3D modely buněčných kultur použity pro screeningové studie léčiv a analýzu biomarkerů. Zakládání buněčných linií z 2D kultur nádorů pocházejících z tkáně pacienta má nízkou úspěšnost a ve 2D prostředí mohou přežít pouze vybrané nádorové buňky, což se může odrazit ve změněné heterogenitě nádoru oproti původnímu nádoru. Dále je dobře známo, že dlouhodobá kultura může selektovat genetické změny. Protože většina 3D kultivačních modelů odvozených od zavedených 2D buněčných linií nezachovává původní fenotyp nádoru, vývoj 3D rakovinových organoidních kultur přímo z pacientovy rakovinné tkáně, která zahrnuje rakovinné kmenové buňky, může lépe rekapitulovat charakter pacientova nádoru než ty odvozené od buňky dříve pasážované jako 2D kultury. Ačkoli existují publikované způsoby generování rakovinných organoidů u různých typů rakoviny, vytvoření rakovinných organoidů HNSCC nebylo pokuseno. Výzkumníci proto měli zájem vyvinout HNSCC rakovinový organoidní model a charakterizovat jeho vlastnosti a porovnat je s rysy originálu.

Metoda rakovinných tkáňových sféroidů (CTOS) je technika pro vytvoření rakovinných organoidních linií, kterou uvádí Kondo et al. který ukázal vysokou míru výskytu rakoviny tlustého střeva, rakoviny plic a rakoviny močového měchýře. Při tomto způsobu se získané buněčné linie kultivují a udržují jako organoidy. Organoidy mají schopnost zachovat stejné histologické rysy původních nádorů. Kromě toho je populace rakovinných kmenových buněk mezi původními nádorovými a organoidními liniemi velmi podobná, což naznačuje, že metoda CTOS může rekapitulovat charakter původního nádoru. V tomto návrhu se výzkumníci pokoušejí vyhodnotit proveditelnost stanovení a charakterizace organoidů HNSCC a užitečnost těchto buněčných linií jako modelu pro screening a testování léků.