Azotan w diecie a mikrobiom jamy ustnej u dzieci z pierwotnym nadciśnieniem tętniczym

Pierwotne nadciśnienie tętnicze (PH) u dzieci i młodzieży jest coraz częściej uznawane za istotny problem zdrowia publicznego. Dane epidemiologiczne z wielu kohort, w tym badania Young Finns Study i innych długoterminowych obserwacji, wykazują, że podwyższone skurczowe ciśnienie krwi rozpoczynające się w okresie dojrzewania przewiduje dysfunkcję śródbłonka, zwiększoną grubość kompleksu błony środkowej i wewnętrznej tętnicy szyjnej oraz wyższe ryzyko chorobowości sercowo-naczyniowej w ciągu życia. Dzieci z PH często wykazują wczesne zmiany podkliniczne, takie jak upośledzona rozszerzalność zależna od przepływu, zwiększona sztywność tętnic, nasilona aktywność współczulna i zmieniona biodostępność tlenku azotu (NO). Pomimo tych ustaleń, wczesne mechanizmy biologiczne przyczyniające się do PH u młodzieży pozostają niewystarczająco scharakteryzowane, a nieinwazyjne biomarkery do wczesnego wykrywania są ograniczone.

Ostatnie postępy w pediatrycznej nauce o układzie sercowo-naczyniowym sugerują, że szlak enterosalivarny azotan-azotyn-tlenek azotu (NO₃ → NO₂ → NO) może odgrywać wcześniej niedocenianą rolę w regulacji ciśnienia krwi. Szlak ten w dużej mierze opiera się na komensalnych bakteriach jamy ustnej zdolnych do redukcji azotanów pokarmowych do azotynów, które są następnie połykane i przekształcane systemowo w NO. Każde zaburzenie tej doustnej zdolności redukcji azotanów przez mikrobiom, czy to z powodu dysbiozy, zaburzonej higieny jamy ustnej, stanu zapalnego, różnic dietetycznych lub zmian ekologicznych podczas dojrzewania, może zmniejszyć biodostępność NO i w konsekwencji podnieść ciśnienie krwi. Kilka badań u dorosłych wykazało, że antybakteryjne płukanki do ust, zmiany w składzie mikroflory jamy ustnej i zmniejszona aktywność redukcji azotanów w ślinie prowadzą do mierzalnego wzrostu skurczowego i rozkurczowego ciśnienia krwi. Jednak dane pediatryczne pozostają niezwykle skąpe, a do tej pory nie opublikowano żadnego kompleksowego badania metagenomicznego mikroflory jamy ustnej u dzieci z PH.

To badanie ma zatem na celu szczegółowe scharakteryzowanie związków między (i) składem mikroflory śliny, (ii) zdolnością konwersji azotanów/azotynów, (iii) biochemicznymi cechami śliny oraz (iv) profilami ciśnienia krwi u młodzieży w wieku 12-18 lat z rozpoznanym pierwotnym nadciśnieniem tętniczym. Co ważne, projekt wykorzystuje nieinwazyjne metody pobierania próbek (ślina stymulowana i niestymulowana), umożliwiając udział dzieci, które mogą nie tolerować wenopunkcji lub inwazyjnych procedur pobierania próbek, oraz zapewniając praktyczny model dla przyszłych narzędzi przesiewowych.

1. Uzasadnienie naukowe i tło 1.1. Nadciśnienie tętnicze u dzieci

   Pierwotne nadciśnienie tętnicze u młodzieży było niegdyś uważane za rzadkie, ale obecnie dotyka do 3-5% nastolatków na całym świecie. Jest silnie związane z otyłością, insulinoopornością, nadmierną aktywacją współczulną, dysfunkcją śródbłonka i przewlekłymi stanami zapalnymi. Chociaż leczenie farmakologiczne jest coraz częściej stosowane, obecne wytyczne pediatryczne kładą nacisk na wczesną identyfikację i niefarmakologiczne strategie zarządzania.

   1.2. Mikroflora jamy ustnej a ciśnienie krwi

   W jamie ustnej bytuje ponad 700 gatunków bakterii, z których wiele uczestniczy w metabolizmie azotanów. Kluczowe rodzaje redukujące azotany obejmują Veillonella, Neisseria, Rothia, Actinomyces i Prevotella. Zaburzenia w tych społecznościach spowodowane dietą, higieną jamy ustnej, częstym stosowaniem płukanek do ust, zapaleniem przyzębia lub układową chorobą podstawową mogą zmniejszyć wydajność redukcji azotanów.

   Kilka badań na dorosłych wykazało, że:

   zahamowanie bakterii redukujących azotany przez płukanki do ust powoduje ostry wzrost ciśnienia krwi,

   suplementacja azotanami pokarmowymi podnosi poziom azotynów w ślinie i obniża skurczowe ciśnienie krwi,

   osoby z niższą zdolnością redukcji azotanów mają wyższe spoczynkowe ciśnienie krwi.

   Jednak dzieci zasadniczo różnią się od dorosłych pod względem ekologii jamy ustnej, dojrzewania immunologicznego, zmian hormonalnych podczas dojrzewania, diety i fizjologii gruczołów ślinowych. Dlatego danych z badań na dorosłych nie można ekstrapolować na populacje pediatryczne.

   1.3. Tlenek azotu, funkcja naczyniowa i ryzyko pediatryczne

   NO jest niezbędny dla homeostazy naczyniowej. Zmniejszona dostępność NO przyczynia się do dysfunkcji śródbłonka, upośledzonej wazodylatacji, zwiększonego napięcia naczyniowego i wczesnej sztywności tętnic. Kilka badań pediatrycznych wykazało:

   podwyższone metabolity NO u dzieci otyłych z powodu przewlekłego stanu zapalnego o niskim nasileniu,

   zaburzone szlaki NO u dzieci z wczesnymi nieprawidłowościami metabolicznymi,

   korelacje między poziomami azotynów w ślinie a systemowymi markerami metabolicznymi.

   Mimo to, żadne badanie nie przeanalizowało jednocześnie składu mikrobiomu jamy ustnej + aktywności reduktazy azotanowej + nadciśnienia pediatrycznego w ujednoliconym frameworku.

2. Cele i hipotezy badania Cel główny

   Określenie, czy młodzież z pierwotnym nadciśnieniem tętniczym wykazuje zmiany w składzie mikroflory jamy ustnej i zmniejszoną zdolność redukcji azotanów w ślinie w porównaniu z normotensyjnymi kontrolami.

   Cele drugorzędne

   Ilościowe oznaczenie azotanów, azotynów, pH, szybkości przepływu, białka całkowitego, aktywności lizozymu w ślinie i skorelowanie ich z poziomami ciśnienia krwi.

   Zbadanie związków między różnorodnością mikrobiomu jamy ustnej (metryki różnorodności alfa/beta) a statusem nadciśnienia.

   Identyfikacja specyficznych taksonów bakteryjnych lub szlaków genów funkcjonalnych (poprzez sekwencjonowanie metagenomiczne) związanych z upośledzoną redukcją azotanów.

   Ocena, czy cechy mikrobiomu śliny mogą służyć jako nieinwazyjne biomarkery wczesnego ryzyka naczyniowego lub nadciśnienia maskowanego.

   Zbadanie związków między szlakami związanymi z azotanami a pomiarami antropometrycznymi, wskaźnikami zdrowia jamy ustnej, dietą i stylem życia.

   Hipotezy

   Dzieci z PH mają odrębny skład mikroflory jamy ustnej z mniejszą obfitością bakterii redukujących azotany.

   Zmniejszona zdolność redukcji azotanów jest związana z niższym poziomem azotynów w ślinie, zmienionym metabolizmem NO i wyższym skurczowym ciśnieniem krwi.

   Specyficzne sygnatury mikrobiologiczne mogą przewidywać nadciśnienie maskowane i wczesną dysfunkcję naczyniową.

3. Projekt badania

   Jest to obserwacyjne, przekrojowe, nieinterwencyjne badanie kliniczne. Nie będą podawane żadne środki terapeutyczne ani suplementy diety. Wszystkie pomiary opierają się na nieinwazyjnych, rutynowych procedurach stomatologicznych i klinicznych w pediatrii.

   3.1. Uczestnicy

   Zostaną zrekrutowane dwie grupy:

   Grupa z pierwotnym nadciśnieniem tętniczym (grupa PH)

   Zdiagnozowana zgodnie z kryteriami nadciśnienia pediatrycznego AAP i ESH.

   Grupa kontrolna zdrowa

   Dopasowana wiekowo i płciowo.

   Normotensyjna na podstawie standaryzowanych pomiarów klinicznych.

   3.2. Wielkość próby

   Na podstawie wcześniejszych szacunków zmienności mikrobiomu i wielkości efektu w badaniach redukcji azotanów u dorosłych, planowane jest minimum 48 uczestników (24 PH + 24 kontrola). Liczba ta jest odpowiednia do eksploracyjnych korelacji metagenomicznych i metabolomicznych. Obliczenia mocy używały α=0,05 i β=0,20 dla różnic w zdolności redukcji azotanów.

4. Procedury zbierania danych 4.1. Pomiar ciśnienia krwi

   Wykonywany przy użyciu pediatrycznych urządzeń oscylometrycznych z regulowanymi mankietami, zwalidowanych do użytku klinicznego.

   Pomiary wykonywane po 5 minutach odpoczynku, w pozycji siedzącej, z użyciem trzech powtarzanych odczytów.

   4.2. Kliniczne badanie jamy ustnej

   Przeprowadzane przez wykwalifikowanego dentystę dziecięcego.

   Ocena obejmuje próchnicę, stan dziąseł i obecność płytki nazębnej.

   4.3. Pobieranie śliny (niestymulowanej)

   Niestymulowana ślina do pomiarów bazowych azotanów/azotynów, pH, szybkości przepływu, białka całkowitego.

   Standaryzowane czasy pobierania (godziny poranne, ≥1 godz. po jedzeniu, piciu, myciu zębów).

   4.4. Pomiary laboratoryjne

   Analizy biochemiczne

   Stężenia azotanów i azotynów za pomocą standaryzowanych zestawów (metody kolorymetryczne).

   Aktywność lizozymu w ślinie (marker odporności wrodzonej).

   Białko całkowite metodą BCA.

   pH za pomocą pasków pH.

   Ekstrakcja DNA metagenomicznego

   Z użyciem zestawu do ekstrakcji DNA mikrobiomu zapewniającego lizę zarówno bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych.

   Przygotowanie bibliotek do NGS

   Zestaw do przygotowania bibliotek metagenomicznych

   Zestaw do kodowania kreskowego DNA

   Ilościowe oznaczanie i normalizacja bibliotek z użyciem zestawów ilościowych opartych na technologii Illumina.

   Sekwencjonowanie

   Wykonywane z użyciem sekwencjonowania sparowanych odczytów Illumina MiSeq 2×300 bp.

   Kroki kontroli jakości obejmują profile wielkości fragmentów, usuwanie chimer i przycinanie adapterów.

   Potok bioinformatyczny

   Filtrowanie jakości FASTQ przy użyciu QIIME2 lub podobnych platform.

   Klasyfikacja taksonomiczna z użyciem baz referencyjnych SILVA/Greengenes/HOMD.

   Analiza funkcjonalna za pomocą PICRUSt2 lub równoważnych narzędzi.

   Analizy różnorodności z metrykami Shannona, Simpsona, Braya-Curtisa.

5. Zarządzanie danymi i zapewnienie jakości 5.1. Walidacja danych

   Wszystkie zebrane dane przejdą kontrole zakresu i logicznej spójności (np. zakresy BP, wiarygodność antropometryczna).

   Automatyczne skrypty będą oznaczać niespójności do przeglądu.

   5.2. Weryfikacja źródła

   Dane kliniczne będą weryfikowane wobec kart pacjentów przez wykwalifikowanych klinicystów.

   Formularze przetwarzania śliny będą skrzyżowane z danymi laboratoryjnymi.

   5.3. Kontrola jakości laboratorium

   Stosowanie kontroli ujemnych/pustych podczas ekstrakcji DNA i przygotowania bibliotek.

   Duplikaty próbek dla ~10% uczestników w celu oceny zmienności technicznej.

   Rejestry kalibracji pipet, termocyklerów i sprzętu do sekwencjonowania.

   5.4. Bezpieczeństwo danych

   Dane przechowywane na zaszyfrowanych serwerach instytucjonalnych za ochroną firewall.

   Tylko upoważnieni członkowie zespołu będą mieli dostęp.

6. Plan analizy statystycznej 6.1. Analiza pierwotna

   Porównanie różnorodności mikrobiologicznej i zdolności redukcji azotanów między grupami PH i kontrolnymi przy użyciu:

   testów Wilcoxona/Manna-Whitneya U

   PERMANOVA dla różnorodności beta

   Analizy różnicowej obfitości (ANCOM, DESeq2)

   6.2. Analizy drugorzędne

   Korelacje Spearmana między biochemicznymi markerami śliny a skurczowym/rozkurczowym BP.

   Wieloraka regresja liniowa z korektą dla BMI, diety, nawyków higieny jamy ustnej.

   Eksploracyjne modele uczenia maszynowego (losowy las) do identyfikacji predykcyjnych cech mikrobiologicznych.

   6.3. Plan postępowania z brakującymi danymi

   Brakujące wartości biochemiczne obsługiwane poprzez wielokrotne imputowanie lub analizę kompletnych przypadków.

   Brakujące dane mikrobiomu z powodu niskiej wydajności DNA będą dokumentowane, nie imputowane.

7. Zagadnienia etyczne

   Badanie to wiąże się z minimalnym ryzykiem. Nie będą pobierane próbki krwi, podawane leki ani interwencje. Pobieranie śliny jest nieinwazyjne i dobrze tolerowane. Procedury zgody i asenty będą przeprowadzane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i krajowymi.

   Zatwierdzenie etyczne uzyskano od Komisji Bioetycznej Badań Klinicznych Wydziału Stomatologii Uniwersytetu w Stambule na posiedzeniu w dniu 14/10/2025 pod numerem 206.

8. Potencjalny wpływ

Projekt może ujawnić nowe, nieinwazyjne sygnatury mikrobiologiczne wczesnego ryzyka naczyniowego u młodzieży. Odkrycia mogą wspierać:

wczesne narzędzia przesiewowe dla nadciśnienia maskowanego lub łagodnego,

strategie prewencyjne oparte na azotanach pokarmowych,

lepsze zrozumienie osi mikrobiom jamy ustnej-naczynia u młodzieży.