Nitrato Dietético e o Microbioma Oral em Crianças com Hipertensão Primária

A hipertensão primária (HP) em crianças e adolescentes é cada vez mais reconhecida como uma importante preocupação de saúde pública. Dados epidemiológicos de múltiplas coortes, incluindo o Estudo dos Jovens Finlandeses e outros acompanhamentos de longo prazo, demonstram que a pressão arterial sistólica elevada a partir da adolescência prediz disfunção endotelial, aumento da espessura íntima-média carotídea e um maior risco vitalício de morbilidade cardiovascular. Crianças com HP mostram frequentemente alterações subclínicas precoces, como dilatação mediada por fluxo prejudicada, aumento da rigidez arterial, atividade simpática elevada e biodisponibilidade alterada de óxido nítrico (ON). Apesar destes achados, os mecanismos biológicos precoces que contribuem para a HP nos jovens permanecem insuficientemente caracterizados, e os biomarcadores não invasivos para deteção precoce são limitados.

Avances recentes na ciência cardiovascular pediátrica sugerem que a via enterosalivar nitrato-nitrito-óxido nítrico (NO₃⁻ → NO₂⁻ → NO) pode desempenhar um papel anteriormente subestimado na regulação da pressão arterial. Esta via depende fortemente de bactérias orais comensais capazes de reduzir nitrato dietético a nitrito, que é depois engolido e convertido em NO sistemicamente. Qualquer perturbação nesta capacidade de redução de nitrato da microbiota oral, seja devido a disbiose, higiene oral deficiente, inflamação, diferenças dietéticas ou mudanças ecológicas durante a adolescência, pode diminuir a biodisponibilidade de NO e subsequentemente aumentar a pressão arterial. Vários estudos em adultos mostraram que elixires orais antibacterianos, alterações na composição da microbiota oral e atividade salivar redutora de nitrato reduzida levam a aumentos mensuráveis na pressão arterial sistólica e diastólica. No entanto, os dados pediátricos permanecem extremamente escassos, sem nenhuma investigação metagenómica abrangente da microbiota oral em crianças com HP publicada até à data.

Este estudo está, portanto, desenhado para caracterizar, em detalhe, as relações entre (i) composição da microbiota salivar, (ii) capacidade de conversão de nitrato/nitrito, (iii) características bioquímicas salivares e (iv) perfis de pressão arterial em adolescentes dos 12 aos 18 anos diagnosticados com hipertensão primária. Importante, o projeto emprega métodos de amostragem não invasivos (saliva estimulada e não estimulada), permitindo a participação de crianças que podem não tolerar venopunção ou procedimentos de amostragem invasivos, e fornecendo um modelo prático para futuras ferramentas de rastreio.

1. Fundamentação Científica e Enquadramento 1.1. Hipertensão Pediátrica

   A hipertensão primária em jovens foi outrora considerada rara, mas agora afeta até 3-5% dos adolescentes globalmente. Está fortemente associada a obesidade, resistência à insulina, sobreativação simpática, disfunção endotelial e estados inflamatórios crónicos. Embora o tratamento farmacológico seja cada vez mais utilizado, as diretrizes pediátricas atuais enfatizam a identificação precoce e estratégias de gestão não farmacológicas.

   1.2. Microbiota Oral e Pressão Arterial

   A cavidade oral alberga mais de 700 espécies bacterianas, muitas das quais participam no metabolismo do nitrato. Géneros redutores de nitrato-chave incluem Veillonella, Neisseria, Rothia, Actinomyces e Prevotella. Perturbações nestas comunidades devido a dieta, higiene oral, uso frequente de elixir oral, inflamação periodontal ou doença sistémica subjacente podem reduzir a eficiência da redução de nitrato.

   Vários ensaios humanos em adultos demonstraram que:

   a supressão mediada por elixir oral de bactérias redutoras de nitrato aumenta agudamente a pressão arterial,

   a suplementação com nitrato dietético aumenta os níveis de nitrito salivar e reduz a PA sistólica,

   indivíduos com menor capacidade redutora de nitrato têm PA em repouso mais elevada.

   No entanto, as crianças diferem fundamentalmente dos adultos na ecologia oral, maturação imunitária, mudanças hormonais durante a puberdade, dieta e fisiologia das glândulas salivares. Portanto, os dados de adultos não podem ser extrapolados para populações pediátricas.

   1.3. Óxido Nítrico, Função Vascular e Risco Pediátrico

   O NO é vital para a homeostase vascular. A biodisponibilidade reduzida de NO contribui para disfunção endotelial, vasodilatação prejudicada, aumento do tónus vascular e rigidez arterial precoce. Vários estudos pediátricos demonstraram:

   metabolitos basais de NO elevados em crianças obesas devido a inflamação crónica de baixo grau,

   vias de NO perturbadas em crianças com anomalias metabólicas precoces,

   correlações entre níveis de nitrito salivar e marcadores metabólicos sistémicos.

   Contudo, nenhum estudo examinou simultaneamente a composição do microbioma oral + atividade da nitrato redutase + hipertensão pediátrica num quadro unificado.

2. Objetivos e Hipóteses do Estudo Objetivo Primário

   Determinar se adolescentes com hipertensão primária exibem alterações na composição da microbiota oral e capacidade salivar redutora de nitrato reduzida em comparação com controlos normotensos.

   Objetivos Secundários

   Quantificar nitrato salivar, nitrito, pH, taxa de fluxo, proteína total, atividade da lisozima e correlacionar estes com níveis de pressão arterial.

   Explorar associações entre diversidade microbiana oral (métricas de diversidade alfa/beta) e estado de hipertensão.

   Identificar taxa bacterianos específicos ou vias de genes funcionais (via sequenciação metagenómica) associados com redução de nitrato prejudicada.

   Avaliar se características do microbioma salivar poderiam servir como biomarcadores não invasivos para risco vascular precoce ou hipertensão mascarada.

   Explorar relações entre vias relacionadas com nitrato e medidas antropométricas, índices de saúde oral, dieta e estilo de vida.

   Hipóteses

   Crianças com HP têm composições microbianas orais distintas com menor abundância de bactérias redutoras de nitrato.

   Capacidade redutora de nitrato reduzida está associada a nitrito salivar mais baixo, metabolismo de NO alterado e PA sistólica mais elevada.

   Assinaturas microbianas específicas podem prever hipertensão mascarada e disfunção vascular precoce.

3. Desenho do Estudo

   Este é um estudo clínico observacional, transversal, não intervencionista. Nenhum agente terapêutico ou suplemento dietético será administrado. Todas as medições dependem de procedimentos dentários e clínicos pediátricos de rotina não invasivos.

   3.1. Participantes

   Dois grupos serão recrutados:

   Grupo de Hipertensão Primária (Grupo HP)

   Diagnosticado de acordo com critérios de hipertensão pediátrica da AAP e ESH.

   Grupo de Controlo Saudável

   Emparelhado por idade e sexo.

   Normotensivo com base em medições clínicas padronizadas.

   3.2. Tamanho da amostra

   Com base em estimativas anteriores de variabilidade do microbioma e tamanhos de efeito em estudos de redução de nitrato em adultos, está planeado um mínimo de 48 participantes (24 HP + 24 controlo). Este número é adequado para correlações exploratórias metagenómicas e de metabolitos. Cálculos de poder usaram α=0,05 e β=0,20 para diferenças na capacidade de redução de nitrato.

4. Procedimentos de Recolha de Dados 4.1. Medição da Pressão Arterial

   Realizada usando dispositivos oscilométricos ajustados com manguito pediátrico validados para uso clínico.

   Medições realizadas após 5 minutos de repouso, em posição sentada, usando três leituras repetidas.

   4.2. Exame Clínico Oral

   Conduzido por um dentista pediátrico treinado.

   Avaliação inclui cáries dentárias, estado gengival e presença de placa.

   4.3. Recolha de Saliva (Não Estimulada)

   Saliva não estimulada para medições basais de nitrato/nitrito, pH, taxa de fluxo, proteína total.

   Tempos de recolha padronizados (horas da manhã, ≥1 h após comer, beber, escovar os dentes).

   4.4. Medições Laboratoriais

   Análises bioquímicas

   Concentrações de nitrato e nitrito via kits padronizados (métodos colorimétricos).

   Atividade da lisozima salivar (marcador de imunidade inata).

   Proteína total via ensaio BCA.

   pH via tiras de pH.

   Extração de DNA Metagenómico

   Usando um kit de extração de DNA do microbioma assegurando lise de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

   Preparação de Biblioteca para NGS

   Kit de preparação de biblioteca metagenómica

   Kit de codificação de DNA

   Quantificação e normalização de biblioteca usando kits de quantificação baseados em Illumina.

   Sequenciação

   Realizada usando sequenciação Illumina MiSeq 2×300 bp paired-end.

   Passos de controlo de qualidade incluem perfis de tamanho de fragmento, remoção de quimeras e corte de adaptadores.

   Pipeline de Bioinformática

   Filtragem de qualidade FASTQ usando QIIME2 ou plataformas similares.

   Classificação taxonómica usando bases de dados de referência SILVA/Greengenes/HOMD.

   Análise funcional via PICRUSt2 ou ferramentas equivalentes.

   Análises de diversidade com métricas de Shannon, Simpson, Bray-Curtis.

5. Gestão de Dados e Garantia de Qualidade 5.1. Validação de Dados

   Todos os dados recolhidos sofrerão verificações de intervalo e verificações de consistência lógica (ex., intervalos de PA, plausibilidade antropométrica).

   Scripts automatizados sinalizarão inconsistências para revisão.

   5.2. Verificação de Fonte

   Dados clínicos serão revistos contra registos do doente por clínicos treinados.

   Formulários de processamento de saliva serão cruzados com dados laboratoriais.

   5.3. Controlo de Qualidade Laboratorial

   Uso de controlos negativos/em branco durante extração de DNA e preparação de biblioteca.

   Amostras duplicadas para ~10% dos participantes para avaliar variabilidade técnica.

   Registos de calibração para pipetas, termocicladores e equipamento de sequenciação.

   5.4. Segurança de Dados

   Dados armazenados em servidores institucionais encriptados atrás de proteção de firewall.

   Apenas membros autorizados da equipa terão acesso.

6. Plano de Análise Estatística 6.1. Análise Primária

   Comparar diversidade microbiana e capacidade redutora de nitrato entre grupos HP e controlo usando:

   Testes de Wilcoxon/Mann-Whitney U

   PERMANOVA para beta-diversidade

   Análise de abundância diferencial (ANCOM, DESeq2)

   6.2. Análises Secundárias

   Correlações de Spearman entre marcadores bioquímicos salivares e PA sistólica/diastólica.

   Regressão linear múltipla ajustando para IMC, dieta, hábitos de higiene oral.

   Modelos exploratórios de machine-learning (floresta aleatória) para identificar características microbianas preditivas.

   6.3. Plano para Dados em Falta

   Valores bioquímicos em falta tratados via imputação múltipla ou análise de casos completos.

   Dados de microbioma em falta devido a baixo rendimento de DNA serão documentados, não imputados.

7. Considerações Éticas

   Este estudo envolve risco mínimo. Nenhuma amostra de sangue, medicação ou intervenções serão dadas. A recolha de saliva é não invasiva e bem tolerada. Procedimentos de consentimento e assentimento serão conduzidos de acordo com regulamentos institucionais e nacionais.

   Aprovação ética foi obtida do Comité de Ética de Investigação Clínica da Faculdade de Medicina Dentária da Universidade de Istambul na sua reunião de 14/10/2025 com o número 206.

8. Impacto Potencial

O projeto pode revelar assinaturas microbianas não invasivas inovadoras de risco vascular precoce em adolescentes. Os resultados poderão apoiar:

ferramentas de rastreio precoce para hipertensão mascarada ou ligeira,

estratégias preventivas baseadas em nitrato dietético,

melhor compreensão do eixo microbioma oral-vascular na juventude.