Plataforma eletrônica bio-reconfigurável para detecção multiplex de patógenos respiratórios virais (BIOPLEX)

O projeto consiste no desenvolvimento de uma plataforma eletrônica que realiza a medição da variação de impedância entre microeletrodos mediante a captura da biomolécula alvo por uma biossonda seletiva previamente enxertada na superfície do biossensor. A sensibilidade necessária será alcançada operando o biossensor no modo lock-in, o que garante a mais alta resolução no rastreamento de variações de amplitude e fase de sinais de impedância (1 ppm foi demonstrado pela POLIMI em outras aplicações). Para melhorar o sinal eletrônico, microesferas de poliestireno, adequadamente funcionalizadas com oligonucleotídeos ou anticorpos, são usadas para ligar o alvo e aumentar a variação de impedância, conforme demonstrado pelos proponentes na detecção bem-sucedida de anticorpos contra o vírus da Dengue. Para abordar vários locais de detecção em paralelo no mesmo chip biossensor, permitindo análises comparativas em tempo real em diferentes alvos da mesma amostra biológica para maior sensibilidade e controle de detecção, uma plataforma eletrônica personalizada será desenvolvida para realizar detecção de impedância diferencial (ou seja, , comparação direta entre o sensor alvo e uma referência) em vários canais. O chip biossensor, feito de borossilicato com microeletrodos de ouro, apresenta uma modificação específica de sua superfície com polímeros funcionais (uma família de polímeros à base de N,N-dimetilacrilamida -DMA) desenvolvidos pela CNR que formam um filme hidrofílico nanométrico na superfície do chip. Os grupos funcionais destes copolímeros permitem a imobilização covalente da sonda preservando sua estrutura ativa, distância espacial, orientação e densidade adequadas, favorecendo a interação com o alvo. O chip biossensor será integrado ao sistema microfluídico já disponível no grupo.

O SARS-CoV-2 será alvo de estratégias desafiadoras. Primeiro, planejamos capturar o vírus inteiro em solução usando anticorpos marcados com DNA direcionados contra a proteína spike do SARS-CoV-2.

A área do sensor, manchada com sondas oligonucleotídicas complementares à sequência de DNA ligada ao anticorpo, irá interagir com os anticorpos marcados com DNA que decoraram toda a superfície do vírus. Para aumentar a variação de impedância da plataforma serão utilizadas esferas de poliestireno: em particular, serão modificadas com o oligonucleótido complementar àquele ligado ao anticorpo que capturou o vírus. Esta metodologia de detecção de vírus inteiro, combinando a captura dos antígenos dirigida por DNA juntamente com uma plataforma de alta sensibilidade para detecção de impedância diferencial, é absolutamente nova e espera-se que seja bem sucedida com base nos resultados já alcançados pelos proponentes na detecção dos anticorpos no sangue humano de pessoas infectadas pelo vírus da Dengue. Paralelamente, pretendemos alargar a utilização da plataforma electrónica também à detecção de antigénios virais, ou seja, Proteína Spike S ou proteína N do nucleocapsídeo. A utilização de antígenos para o diagnóstico da infecção, em vez do vírus inteiro, pode levar a importantes desistências práticas, pois não necessita de nenhum requisito específico de segurança, permitindo assim que o teste seja realizado em qualquer local , em particular farmácias ou clínicas médicas, de forma semelhante aos testes padrão de fluxo lateral antigênico.

Este é um estudo retrospectivo monocêntrico para testar amostras respiratórias para avaliar a sensibilidade analítica da plataforma que está sendo desenvolvida no projeto PRIN Prot. 2022EJL28B. As amostras são preenchidas de forma anônima e as análises das amostras são realizadas para verificar a capacidade do dispositivo em revelar a presença de partículas virais na matriz biológica, como amostras respiratórias ou, quando necessário para montagem de instrumentos, amostras de plasma randomizadas e anonimizadas. Nenhum paciente ou uso de dados clínicos estará envolvido no estudo, mas apenas serão utilizadas as amostras armazenadas no biobanco clínico-biológico institucional San Raffaele COVID-19 (COVID-BioB, NCT04318366). As amostras utilizadas para o estudo foram coletadas no período de 19/03/2020 a 31/05/2024.