Biosignidades de doenças no espectro ALS/FTD: novas perspectivas biológicas impactantes além das abordagens clínicas (SPECTRALS)

A esclerose lateral amiotrófica (ALS) e demência frontotemporal (FTD) são consideradas duas manifestações da mesma doença, compartilhando características clínicas, genéticas e patológicas comuns. Ambas as doenças podem até co-ocorrer no mesmo paciente, no entanto, os mecanismos subjacentes desencadeiam ALS, FTD ou seu fenótipo misto não são totalmente compreendidos. Infelizmente, ainda faltam biomarcadores confiáveis ​​para o diagnóstico clínico de ALS/FTD. O objetivo deste projeto é empregar uma abordagem multidisciplinar de ponta para investigar não apenas amostras tradicionais de líquido cerebroespinhal (LCR), mas também outros tecidos facilmente acessíveis, como pele, mucosa olfativa (OM), soro e lágrimas. Este projeto pretende descobrir novos biomarcadores capazes de reconhecer fenótipos clínicos ALS/FTD, fortalecer o diagnóstico clínico de fenótipos específicos (por exemplo ALS de início bulbar versus espinhal), preveja pacientes em risco de desenvolver um fenótipo de doença mista (ALS+FTD ou vice -versa), avalie a eficácia de tratamentos terapêuticos e capaz de revelar mecanismos biológicos específicos envolvidos no início e na progressão de cada doença. O valor agregado do projeto é que ele explorará o ALS/FTD de um ponto de vista periférico usando tecidos que ainda precisam ser examinados completamente neste campo de pesquisa. Esses tecidos serão submetidos a análises diretas para a descoberta de biomarcadores ou processadas para executar estudos celulares e estruturais úteis para aprofundar nossa compreensão do processo neurodegenerativo de ALS/FTD e descobrir novas moléculas ou mecanismos de drogas. Para atingir nossos objetivos, o primeiro ano do projeto será dedicado a inscrever pacientes, realizando também um estudo retrospectivo usando amostras de LCR, soro, lágrimas e OM já disponíveis coletadas de uma coorte extensivamente caracterizada de pacientes com BALS, Sals, FTD, bem como indivíduos com outras condições neurológicas não-neurodenerativas (NNC). Essas amostras serão submetidas às seguintes análises (1) NGS, (2) SIMOA (para quantificar as proteínas NFL, tau, fosfo-tau e beta-amilóide), (3) microfluídicos (para determinar o miRNA e os perfis de RNA não codificadores), (4) bioplex (a avaliar o patrimônio líquido; (5) Ensaio de amplificação de sementes (para detectar o TDP-43 periférico TDP-43) e (6) MiSEQ Illumina (para analisar a composição da microbiota). Para análises microfluídicas e bioplex, o estudo retrospectivo servirá para a descoberta de biomarcadores. Considerando que, para as análises de SIMOA, SAA e MiSEQ, este estudo permitirá a coleta de dados preliminares fundamentais e ajuste fino dos procedimentos analíticos. Os candidatos já obtiveram dados promissores, mostrando que o perfil do miRNA no soro e o conteúdo de TDP-43 em OM (SAA) poderia discriminar entre BALS e Sals. Esses achados sugerem que o perfil molecular e biológico é viável e pode impactar tangivelmente o diagnóstico de ALS/FTD. O segundo ano do estudo se concentrará em sujeitar as amostras recém -coletadas às mesmas análises descritas anteriormente, para validação de biomarcadores ou para coletar todos os dados necessários e essenciais para determinar se e até que ponto algumas alterações periféricas realmente diferem entre as patologias. Todos os dados serão processados ​​pelo Grupo de Centros de Ciência de Dados (bioinformáticos especializados, estatísticos, matemáticos e neurobiologistas) para avaliar se nossos achados permitem a identificação de biosignidades de doenças no espectro ALS/FTD.

The research group is composed of four operative units (OUs): Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta (UO1), Università degli Studi di Napoli "Federico II" (UO2), Consorzio Interuniversitario Risonanze Magnetiche Metallo Proteine ​​(UO3) and Azienda Ospedaliero Universitaria di Sassari (UO4). Foi decidido incluir um grupo da Sardenha (UO4) porque é uma das regiões italianas com a maior incidência de ELA e contribuirá para a inscrição de pacientes com apresentações clínicas mais heterogêneas. OU1 e UO4 serão responsáveis ​​por selecionar amostras biológicas retrospectivas e recrutar pacientes com ALS/FTD e NNC no primeiro ano do estudo. As amostras do LCR, sangue, lágrimas, pele e OM foram ou serão coletadas usando procedimentos padronizados e compartilhados por OU1 e UO4 de um total de Sals (n = 105), BALS (n = 32), FTD (n = 66) e NNC (n = 27) pacientes. Um subconjunto de amostras coletadas de Sals (n = 45), BALS (n = 12), FTD (n = 30) e NNC (n = 12) já está disponível em UO1 e UO4 e será analisado durante o primeiro ano de inscrição de novos pacientes. Todos os sujeitos recrutados serão submetidos a extensas avaliações clínicas e neuropsicológicas e serão submetidas ao teste de Burghart Sniffin 'Sticks antes do LCR, sangue, om, pele e lágrimas. As amostras serão distribuídas e analisadas por cada UO da seguinte forma: o CSF ​​será preparado para análise SIMOA no UO4 ou para (1) miRNA e RNA não codificador longo e (2) análises de SAA em UO1. O sangue será processado imediatamente em UO1 e UO4 para isolar a fração de soro que será analisada na UO4 (medição SIMOA de NFL, amilóide-beta, tau e fosforilada em níveis de RNA (p-tau) de threonina. As lágrimas estarão preparadas para o miRNA e o RNA não codificante longo ou para análises de SAA em UO1. OM estará preparado para (1) miRNA e RNA não codificante longo, (2) SAA e (3) análises de microbiota em UO1. Finalmente, a pele será preparada para (1) miRNA e RNA não codificante longo ou (2) análises SAA em UO1 e serão processadas para obter fibroblastos celulares primários que serão enviados para UO2 para (3) estudos de biologia celular, incluindo análise de microscopia de super-resolução de agregados intracelulares e caracterização molecular da sua internação/degradação/degradação. Finalmente, o UO3 (1) produzirá TDP-43 recombinante (para análises SAA realizadas em UO1) que possuem recursos especiais úteis para produzir espectros de RMN de boa qualidade para caracterização estrutural detalhada e (2) analisar os produtos SAA selecionados por proteína-NMR. Todos os dados gerados neste projeto, incluindo todas as informações clínicas e psicológicas relevantes, serão analisadas por membros do grupo Centro de Ciência de Dados (DSC) que foram criados recentemente na UO1. O DSC combina a experiência de bioinformáticos, estatísticos, matemáticos e neurobiologistas com o objetivo de aplicar metodologias analíticas sofisticadas a dados clínicos, ômicos e de imagem. Finalmente, outros colaboradores (consulte a seção apropriada) que trabalham na UO3 ajudarão no estudo Protein-RMN. Assim, a colaboração sinérgica entre todas as UOS é vital para alcançar os objetivos do projeto.