核桃、长链多不饱和脂肪酸与青少年大脑发育 (WALNUTs)

青春期，大脑发育的重要机会窗口和脆弱期 尽管研究较少，但青春期也是大脑发育的关键时期。 大脑经历了重要的组织变化，促性腺激素释放激素的重新出现触发了一系列激素依赖过程。 其他生物过程涉及表观遗传因素，这些因素对环境高度敏感，因此可能使这一生长期更容易受到外部侵害 (Morrison, 2013)。 此外，执行内部引导行为（情绪控制）、逻辑思维、工作记忆和组织技能（执行功能）等重要功能的前额叶皮层是大脑最后成熟的区域（二十出头）。 前额叶皮层的突触可塑性在青春期得到加强，这一过程涉及灰质密度的降低、白质体积、脑血流量和突触修剪的增加。 青春期也是大脑连通性和复杂行为完善的时期 (Selemon, 2013)。 人们普遍认为大脑的突触可塑性随着年龄的增长而降低（Morrison, 2013; Selemon, 2013），但这种模式似乎并不遵循线性趋势，而青春期是大脑发育可以得到增强和发展的重要时期免受具有长期后果的环境危害（从空气污染到社会压力的一切）。 需要更好地了解环境影响人类大脑发育的生物学途径，特别是在青春期，当最复杂的行为被提炼到成熟的成年期时。

长链多不饱和脂肪酸、核桃与大脑发育 孕期、哺乳期、儿童期和青春期的营养对整体发育具有根本性影响。 必需脂肪酸是人体无法自行合成的长链多不饱和酸（LCPUFAs），必须通过饮食（主要来自含油鱼类、种子和坚果）获取。 其中三种脂肪酸在大脑发育中起着重要作用：omega-3（二十二碳六烯酸 (DHA) 和二十碳五烯酸 (EPA)）和 omega-6（花生四烯酸 (AA)）（McCann，2005 年）。 LCPUFA 约占大脑干重的 15% 至 30%（Hallahan，2005 年），并且在生命的各个阶段参与中枢神经系统的功能和结构。 研究表明，DHA 调节神经传递系统，例如血清素能系统、多巴胺能系统、去甲肾上腺素能系统和乙酰胆碱能系统 (Fontani, 2005)。 在所有可食用植物中，核桃的 omega-3 脂肪酸、α-亚麻酸 (ALA) 含量最高。 ALA 是 DHA 和 EPA 的前体，这两种脂肪酸是大脑最必需的脂肪酸（Carey，2013 年）。 核桃还富含纤维、维生素、矿物质和其他生物活性物质，例如酚类抗氧化剂和植物甾醇（Bao，2013 年）。 几项研究证实，在每天少量核桃的短期干预后，血液中 n-3 多不饱和脂肪酸水平有所增加，血脂水平有所改善（Marangoni，2007 年；Maranhao，2011 年）。 虽然大多数人类研究表明摄入核桃对心血管有益（Poulose，2014 年），但仍有必要研究核桃对大脑发育的潜在有益影响，一些针对成人的早期研究显示在认知方面取得积极成果，这些结果在背景中有进一步描述部分（Pribis，2012 年；Sánchez-Villegas，2011 年）。 这些在成年人身上的发现为核桃对大脑发育的潜在益处提供了概念证明，而这在青少年中从未被研究过。

可以通过使用基于人群的随机对照试验来研究这个问题，以评估核桃摄入量是否对青少年大脑功能产生有益影响（使用神经心理学评估）。 推荐和促进核桃摄入量（30 克/天；Marangoni，2007 年；Maranhao，2011 年）在很长一段时间内（例如 12 个月；de Ruyter，2012 年）是合乎道德和可行的。 一颗加州核桃含有约 0.40 克的 n-3 多不饱和脂肪酸（美国农业部国家标准参考营养数据库，2012 年），因此每天吃几颗核桃（核 30 克）就可以满足每天摄入至少 1 克 n-3 多不饱和脂肪酸的建议（美国国家科学院医学研究所食品与营养委员会，2014 年）。 年轻的西班牙成年人（16-25 岁）平均每天吃大约 10 克坚果（Salas，2013 年）。 海产品也含有高浓度的 n-3 多不饱和脂肪酸，但由于海产品含有甲基汞（一种重要的神经毒性环境污染物），因此禁止对海产品进行干预（Grandjean，2014 年）。 使用核桃的一个局限性是摄入量不如每天服用 1 克 DHA 的药丸补充剂那么一致，尽管这种特定的食物建议在社会上具有成本效益，并且在全球健康背景下会被更广泛的人遵守。

神经心理学和行为评估，使用重复测量 最近将神经心理学评估纳入我们来自 INMA 的队列研究的经验（环境与儿童，Guxens，2012 年）导致神经心理学家和流行病学家之间富有成果的知识交流。 在重复检查中进行的计算机化神经心理学测试是研究普通人群高阶脑功能和发育的最敏感工具（Julvez，2010）。 此外，基于人群的研究表明，这些测试对环境和营养决定因素的影响非常敏感（Julvez，2013 年）。 研究人员将以这一经验为基础，有效地选择合适的测试范围，以涵盖青春期迅速发展的复杂神经功能，例如工作记忆、执行功能、运动速度、视觉推理、选择性和持续注意力以及抑制功能的计算机测试（西蒙，2012 年）。 此外，神经心理学测试将辅以行为评定量表，旨在涵盖青春期早期非常重要的社会情感终点（Selemon，2012；Morrison，2013）。 评估其他行为领域（即社交能力和 ADHD 症状）的事实可能会丰富对调查结果的解释，并且可能有助于进一步了解内在机制。 一个限制是由于选择了非常分散的行为区域而不考虑它们之间的联系而失去结果一致性的风险。 最好的选择是仔细选择神经心理学和行为学工具，这些工具可以有效地涵盖青少年大脑发育的多个领域。 只有少数 11 岁以上青少年的 n-3 PUFA 试验使用了基于计算机的神经心理学测试（Janssen，2014）。 最近一项针对健康年轻人的大型随机对照试验使用计算机化认知测试发现，在补充 DHA 6 个月后，反应时间延迟和工作记忆得到改善（Stonehouse，2013 年）。 一项针对 ADHD 儿童（7-12 岁）的双盲、安慰剂对照试验未发现任何治疗关联，但在观察数据中，据报道 DHA 水平与分散注意力的计算机化测试分数之间呈正相关（Milte，2012 年） . 尚未在健康的年轻青少年中使用同一受试者重复计算机化测试来测量神经心理功能的大型试验，而这是更好地了解“正常”大脑发育所必需的。

具体假设是：

1. 六个月的核桃摄入量干预将增强普通人群青少年的神经心理发育。 研究人员希望在干预后发现两组（对照组/核桃）之间的差异。
2. 为期六个月的核桃摄入量干预将促进普通人群青少年的行为（社会情感）发展。 研究人员希望在干预后发现两组之间的差异。
3. 六个月的核桃摄入干预将增加体内 n-3 多不饱和脂肪酸的可用性，这将在至少 200 名青少年的血液子样本中进行测量。 调查人员希望在干预后发现两组 (100/100) 之间的差异。
4. 血液中的 n-3 PUFA 水平与大脑发育有关。

全球目标 这项基于人群的随机对照试验的全球目标是调查每天摄入 30 克核桃仁（或约 1.5 克 n-3 多不饱和脂肪酸）是否有益于青少年的大脑发育。 用于评估大脑功能的复杂工具的组合，例如计算机化的神经心理学测试，将提供检测营养干预效应导致的大脑发育甚至细微变化所需的精确数据。 使用行为评级量表的进一步评估将使我们更广泛地了解干预的潜在影响。

具体目标

1. 确定长期干预（每天 30 克核桃仁，持续 6 个月）在增强神经心理发育方面的有效性。 该项目将使人们对核桃摄入量（作为 n-3 多不饱和脂肪酸摄入量的替代品）在青少年大脑发育中的作用有了新的认识。 由于不同社会群体对此类干预措施的负担能力，这对全球健康干预措施具有重要影响。 公共卫生研究的一个主要目标是制定有效、具有成本效益且可行的健康建议。
2. 确定长期干预（每天 30 克核桃仁，持续 6 个月）在促进行为发展方面的有效性。 结合神经心理学（或认知）发展，青少年行为（社会情感）发展对于更广泛地评估大脑发育至关重要。
3. 研究干预对血液中 n-3 PUFA 水平的影响，并研究 n-3 PUFA 水平与大脑发育之间的关联。 这里的重要性取决于了解干预和大脑发育之间的潜在生物学途径。

次要目标评估通过 FFQ 测量的饮食与青少年神经心理功能的关联。

评估通过一般健康问卷评估的生活习惯与青少年神经心理功能的关联。

评估 LUR 模型估计的环境空气污染与青少年神经心理功能的关联。

评估青春期不同行为领域之间的关联。

评估核桃干预与氧化应激通路、炎症系统和脑功能相关的生物标志物之间的关联。 这些生物标志物与来自大脑的候选循环 miRNA 和一组来自 5 种不同类别（酰基肉碱、氨基酸、己糖、磷酸和鞘脂以及生物胺）的代谢物有关。

方法论 WALNUTB 的科学方法包括一项雄心勃勃的随机对照试验，该试验基于大量人口样本。 样本：该试验将包括来自巴塞罗那市（1,900,000 居民）的每组 400 名健康青少年（12-15 岁），参与者将被随机分配到两组（干预组和对照组）并随访 6 个月（de Ruyter , 2012) 和两个相同的脑功能多模式评估系列（干预前后），以及 n-3 PUFA 的生物标志物。 神经心理学结果的功效计算：将 400 名参与者分配到干预组和对照组，并考虑了 6 个主要结果，它们之间的相关性为 0.25。 结果被认为具有平均 100 和标准差 15，与一般人群中的许多神经心理学分数一样。 待检测的干预效果为3分。 我们考虑了 0.05 的 I 类错误，并使用 Benjamini-Hochberg 方法校正了多重性计算。 假设有 10% 的失访率。 此外，我们假设最终模型的 R2 为 20%。 考虑到所有这些因素，由此产生的研究将有 95% 的功效检测到与至少一种结果的关联，90% 检测到至少两种结果，80% 检测到至少 3 种结果，70% 检测到至少 4 种结果，55% 检测到至少一种结果检测至少 5% 和 31% 以检测与所有六个结果的关联。

WP 1：核桃干预：设计和环境：由于干预的性质，该试验不能设盲。 除了一般健康饮食建议（如干预组）和后续评估外，对照组将不接受任何干预。 招募：护士将与巴塞罗那的 20 所高中合作招募青少年（每组 n=400）。 实施和坚持：调查人员将执行按年龄和性别分层的随机抽样，将受试者分配到两组之一。 所有家庭都将收到一份关于遵循健康饮食的基本指南，以确保实施和坚持。 干预组的家庭将收到有关如何鼓励青少年在 6 个月内每天吃 30 克核桃的额外说明，研究人员将免费提供这些核桃。 护士将每 3 个月与这些家庭联系一次，进行一次简短的检查访谈，并进行食物频率问卷调查 (FFQ)。

WP 2：实地考察和神经心理学评估：研究人员将验证和标准化计算机化测试，以减少评估过程中观察者之间的差异，并确保数据自动记录无误。 此外，自我报告和国际验证的心理测量量表将用于进一步评估青少年的社会情感行为。 在这个项目中，研究人员将利用神经心理学家和流行病学家之间的互动来测试一系列神经心理学功能，涵盖青春期正在发展的各种复杂行为。

WP 3：研究干预效果和 omega-3 多不饱和脂肪酸的作用：为了研究干预效果，必须对结果进行有效测量（WP2），中间因素的有效测量也是如此，在此病例血浆 n-3 PUFA 水平。 血液样本将在基线和干预后收集，离心，血浆样本储存在 -80°C 直至分析。 统计分析：将进行以下统计分析：1)使用针对基线水平调整的线性回归模型评估干预对n-6 PUFA与n-3 PUFA比率（n6-n3比率）的影响。 2）评估干预对大脑发育的影响，使用上述1）中描述的方法； 3) 评估基线时 n6-n3 比率对大脑发育的影响，以及 n6-n3 比率变化对从基线到后续的大脑发育变化的影响。 4) 评估由 n6-n3 比率变化介导的干预对大脑发育影响的比例。 这个比例可以通过比较有和没有中介的模型的结果来计算。 分析 1)、2) 和 3)（即 那些涉及干预的）将基于意向治疗，即使用干预（否/是）而不考虑依从性，以估计政策的效果（即鼓励每天吃 30 克核桃），而不是比食用核桃的效果。

时间框架：研究人员希望在前 12 个月（自 2015 年 1 月开始）进行招募和设计干预并进行试点，并在 12-24 个月内实施干预并进行随访。 基线和最终评估将在 24 个月后完成（如果调查人员包括 2015 年），实地工作的总持续时间为两年，需要第三年进行数据分析。