碳青霉烯类异种耐药与碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌血流感染的比较 (COMBAT)

主要目标：

1. 构想肺炎克雷伯菌菌株间碳青霉烯类异耐药现象的临床相关性。
2. 肺炎克雷伯菌碳青霉烯类异耐药分子耐药机制的鉴定
3. 梯度测试精度的鉴定（例如 E-test) 和纸片扩散试验检测碳青霉烯类异抗性与金标准 PAP 分析相比

假设

主要假设

由 CRKp 引起的血流感染的 1-30 天死亡率高于碳青霉烯异耐药肺炎克雷伯菌

次要假设

1. CRKp 和碳青霉烯异耐药 Kp 组的 90 天复发/再感染率相似。 然而，碳青霉烯类单药疗法在治疗由碳青霉烯类异耐药性肺炎克雷伯菌引起的血流感染时与较高的复发率/再感染率相关，即使用作高剂量和延长的输注方案。
2. 碳青霉烯异耐药Kp组14天临床治愈率明显高于CRKp组。
3. 由碳青霉烯类异耐药肺炎克雷伯菌引起的 BSI 患者接受碳青霉烯类单药治疗后，14 天临床治愈率显着降低。
4. 碳青霉烯异耐药Kp组7天微生物学治愈率明显高于CRKp组。
5. 由碳青霉烯异耐药性肺炎克雷伯菌引起的 BSI 患者接受碳青霉烯单药治疗后，7 天微生物学治愈率显着降低。

学习规划：

前瞻性多中心跨国研究

设置和学习时间：

来自世界不同地区的三级医院将被纳入 COMBAT 试验。 研究期计划为 01.04.2020-01.04.2021 或更长，直到达到预定的样本量。 当地（主要）研究人员将收集参与者的微生物学和临床数据。 现场调查人员将每天筛选微生物学实验室数据，以确定患有 CRKp 或碳青霉烯类耐药 Kp 菌血症的患者。 所有连续患有单细菌 CRKp 或碳青霉烯类耐药 Kp BSI 的患者都将有资格接受评估以纳入该研究。 将根据 2015 年 CDC 标准确定碳青霉烯耐药性。 通过对碳青霉烯类抑菌圈部分亚菌落的观察，初步判断Kp血培养分离株是否存在碳青霉烯类异耐药性。 仅对一种类型的碳青霉烯类药物（包括厄他培南、亚胺培南、美罗培南）存在异种耐药性就足以被纳入。 在进行纸片扩散试验或梯度试验（例如 电子测试）在我们的日常实践中。 然而，这些用于鉴定革兰氏阴性微生物中碳青霉烯类异质抗性的试验的确切敏感性和特异性尚不清楚。 由纸片扩散或梯度试验结果定义的碳青霉烯类异种耐药 Kp 引起的 BSI 的参与者将被招募到碳青霉烯类异种耐药 Kp 组。 然而，临床碳青霉烯类异种耐药 Kp 分离株将通过适当的转移培养基转移到每个国家/地区预先确定的参考中心。 将在参考中心对这些病原体进行种群分析（PAP）。 PAP虽然是鉴定碳青霉烯类异抗性的推荐方法，但微生物实验室常规使用比较麻烦。 根据常规微生物学方法怀疑患有碳青霉烯类异种耐药 Kp 的 BSI 的参与者最初将被包括在内，并将记录这些患者的数据，但是，如果 PAP 分析未证实存在异种碳青霉烯类，这些患者将被排除在我们的最终分析之外-对这些病原体的耐药性。 PAP 分析将用作鉴定肺炎克雷伯菌分离株中碳青霉烯类异抗性的确认试验。 PAP 将在患者招募结束时和参考中心收集所有分离株后进行。 因此，治疗决策和任何其他干预措施都不会受到 PAP 分析结果的影响。 PAP 仅作为金标准方法用于鉴定可疑分离株中是否存在碳青霉烯异耐药性。 这项研究将纯粹是观察性的，不会对患者随访的任何部分进行干预（例如 诊断、治疗等），所有决定将由主治医师做出。 简而言之，PAP 分析将如下进行：将来自在 Columbia 琼脂上过夜生长的培养物的一个菌落接种到 5 ml Luria-Bertani 肉汤中。 孵育 24 小时后，将 0.1 ml 密度对应于 0.5 McFarland 的细菌悬液连续稀释并铺展到 Mueller-Hinton 琼脂上，该琼脂含有浓度范围为 0.25 至 256 mg/L 的美罗培南、亚胺培南、厄他培南的两倍连续稀释液。 将 0.5 McFarland 悬浮液的 100 微升 10 倍系列稀释液涂在无药物 Mueller-Hinton 琼脂上，并在 37 °C 下孵育 48 小时以确定 CFU/ml。 对所有分离株进行三个复制板的菌落计数，并估计平均值。 计算 0.1 ml 起始细菌悬浮液中的耐药细胞数，并将 log CFUs/ml 与抗生素浓度作图。 将计算最高药物浓度下的异种耐药亚群的频率，并将在含抗生素平板上生长的菌落数除以接种到无抗生素平板上的相同细菌接种物的菌落计数。 将准备 PAP 分析协议并将其发送到参考中心，以便在每个参考中心使用相同的技术更顺利地执行 PAP。 现场调查人员还将收集 CRKp 分离株并将这些分离株保持在适当的条件下，直到转移进行分析。 所有 CRKp 分离株将被送到每个国家的中央微生物实验室，通过多重 PCR（聚合链反应）鉴定碳青霉烯酶基因。

样本量：

据我们所知，文献中没有研究调查由碳青霉烯类异耐药革兰氏阴性菌引起的血流或其他类型侵袭性感染的临床结果。 因此，本研究将作为试点研究进行。 尽管如此，CRKp 组的 200 名参与者和碳青霉烯异耐药性肺炎克雷伯菌组的 100 名参与者计划参与。

跟进：

将在第 7 天通过控制血培养和主要感染源培养评估参与者的微生物根除情况。 如果在随访 7 天内未根除致病病原体，则必要时将在 7-28 天之间进行连续培养。 还将在第 7 天和第 14 天使用相关参数评估患者的临床反应。 在指数血培养日期后，将对所有参与者进行 90 天的跟踪。 在此随访期间，将从血培养取样开始定期评估，如果参与者出院，将每月一次对参与者进行任何感染（血流或其他类型的侵入性感染）的主要评估。 参与者将被警告在出现感染症状（例如发烧、发冷）时在 90 天的随访期结束之前向我们的中心提出申请。 此外，当参与者到达医院诊所或急诊室时，参与者将被告知致电作为本研究中特定中心的主要研究者的医生。 主要研究人员将根据临床需要评估参与者并发送他们的培养样本。 在审查培养结果和临床表现后，患者将被分配到碳青霉烯类耐药或碳青霉烯类异耐药肺炎克雷伯菌感染组。 如果参与者在 90 天完成之前出院，将每隔 30 天通过电话联系他/她以评估调查结果。

微生物分析：

• 抗菌药物敏感性试验 (AST) 将在每个中心进行，不再重复。 因此，AST结果将从医院数据库中获取。
• PAP (Population analysis profiling) 将在每个国家的参考中心进行，以在梯度测试（例如 E-测试）或纸片扩散测试中识别出抑制区内的某些亚群的疑似分离株中识别实际异源耐药分离株
• 多重 PCR 将用于鉴定碳青霉烯酶的类型（将在参考中心进行）
• 全基因组测序将用于鉴定临床分离株中碳青霉烯类异抗性的分子机制（将在参考中心进行）
• 粘菌素耐药性将通过微量肉汤稀释法进行研究（将在参考中心进行）
• EUCAST 断点将用于鉴定对所有抗生素的耐药性，但应用 FDA 断点的替加环素除外。
• 碳青霉烯类、多粘菌素、替加环素、丁胺卡那霉素和庆大霉素的抗菌药物敏感性和 MIC 值的结果将用于 PAP 分析中鉴定的大多数耐药亚群。 上述抗生素的 MIC 值将在参考中心使用肉汤微量稀释法进行分析。 对于其他抗生素，将记录亲本分离株的 AST 结果并从医院数据库中获取。

统计分析：

根据变量的类型，使用中位数（四分位数间距）或频率计数来描述变量。 如果单元格的频率为 5 或更少，则分类变量将通过 Pearson 的卡方检验或 Fisher 的精确检验进行比较，对于非正态分布的变量通过 Wilcoxon-Mann-Whitney U 检验或对于正态分布的变量进行学生 t 检验来比较连续变量。 通过使用单变量分析来定义比较组之间具有显着差异的变量，从而比较各组（CRKp 与碳青霉烯类异抗性）。 P 值为 0.20 或更小的所有单变量将通过根据临床价值及其关联以向后逐步方式手动选择它们来包含在多变量 Cox 回归模型中。 将为纳入多变量模型的每个变量计算 VIF（方差膨胀因子）。 将根据似然比检验选取最适合的模型。 在另一项比较CRKp组和碳青霉烯异耐药组的分析中，将计算倾向得分并将该得分作为混杂参数纳入cox回归分析模型。 Cox 回归分析将用于比较相关结果，例如 30 天死亡率和 14 天临床治愈率。

将第一次阳性血培养后30天的存活率绘制成Kaplan-Meier曲线，并通过对数秩检验比较存活率，以评估碳青霉烯类异耐药性的影响。 所有测试都是双尾的，在 SPSS 软件（20.0 版；SPSS Inc., Chicago, IL, USA）中显着性设置为 0.05。