Přežití červených krvinek (RBC) po transfuzi u kojenců

Fáze I: Zahrnuje pouze cíl č. 1 z grantu Thrasher Foundation, ve kterém budou studovány dospělé subjekty.

KONKRÉTNÍ CÍL č. 1 (Grant Thrasher Foundation): Vyvinout in vitro a ověřit in vivo u dospělých lidí a anemických kojenců schopnost biotinylovat erytrocyty při až 5 diskrétních hustotách pro současné stanovení kinetiky RBC mnoha různých populací RBC. To vyžaduje rozšíření technologie značení RBC biotinem, kterou jsme dříve vyvinuli. Po upřesnění bude metoda aplikována v následných cílech prováděných u anemických kojenců, kteří dostávají klinicky objednané transfuze červených krvinek.

Jak naznačují naše předchozí studie přežití červených krvinek, očekáváme, že nejtěžší značení biotinem změní vnitřní strukturální vlastnosti červených krvinek a zkrátí jejich dlouhodobé přežití. Validační studie in vitro a in vivo, které navrhujeme u dospělých, jsou nezbytné, protože podmínky pro reprodukovatelné získání diskrétních hustot biotinu RBC ve vhodných, těsně rozmístěných intervalech nebyly přesvědčivě vypracovány, ani jsme empiricky neurčili, která z pěti hustot nebude uměle zkrátit dlouhodobé přežití červených krvinek. Můžeme použít lehčí hustoty pro měření přežití červených krvinek a těžší hustoty pro současná měření objemu červených krvinek potřebná k zohlednění nárůstu objemu červených krvinek způsobeného růstem. Je důležité provést tyto studie proveditelnosti jak u dospělých, tak u kojenců z důvodu značně odlišných fyziologických stavů, tj. normální, zdraví dospělí jsou v ustáleném stavu erytropoézy, zatímco kriticky nemocní, anemičtí kojenci zažívají četné klinické okolnosti, které narušují přežití červených krvinek, např. růst flebotomie, intervenční transfuze atd.

Kromě biotinového značení RBC metody bude u kojenců, kteří dostávají alogenní transfuze erytrocytů, aplikována „diferenciální aglutinační, antigenní metoda“ využívající průtokovou cytometrii. Výsledky obou metod budou vzájemně porovnány. Metoda diferenciální aglutinace využívá rozdíly v povrchových antigenech červených krvinek mezi dárcem a příjemcem pro stanovení krátkodobého a dlouhodobého přežití červených krvinek. Výsledky genotypizace RBC antigenů dospělých dárců a kojenců (prováděné v Mississippi Valley Regional Blood Center) umožňují identifikaci menších rozdílů krevních skupin mezi dárci a příjemci RBC tak, aby byly vhodně označené minoritní RBC protilátky (komerčně dostupné a používané krevními bankami pro minoritní typizace erytrocytů podle krevní skupiny) lze použít při stanovení přežití erytrocytů pomocí průtokové cytometrie. Přežití erytrocytů stanovené pro každou z biotinových značek a pro antigenní rozdíly v erytrocytech budou všechny vzájemně porovnány. Metoda diferenciální aglutinace/antigenu bude považována za „zlatý standard“, protože erytrocyty jsou značeny ex-vivo, PO transfuzi erytrocytů, tedy bez modifikace povrchových proteinů RBC membrány jako biotinylace. Naší hypotézou je, že přidání příliš velkého množství biotinu může vést k uměle zkrácenému in vivo přežití červených krvinek, ale nižší dávky biotinu nikoli. Zahrnutím výsledků diferenciální aglutinace/antigenové metody přežití červených krvinek budeme moci lépe ověřit naši hypotézu multi-denzitního biotinu.

Naším celkovým cílem v tomto výzkumu je zlepšit postupy transfuze červených krvinek (RBC) u anemických, kriticky nemocných kojenců. Tento projekt získal podporu od dvou grantových agentur: 1) Thrasher Foundation s názvem „Obnova červených krvinek a přežití po transfuzi u kojenců“; a 2) Grant NIH PPG P01 HL046925, Projekt 1 s názvem "Přežití červených krvinek po transfuzi u kojenců." Abstrakty pro oba jsou uvedeny níže. Tento projekt bude dokončen ve dvou fázích:

Fáze I zahrnuje studie autologních biotinylovaných červených krvinek transfundovaných normálním zdravým dospělým lidským dobrovolníkům (viz Specifický cíl č. 1 v abstraktu Thrasher Foundation níže); a

Fáze II zahrnuje studie kojenců vyžadujících transfuzi červených krvinek na objednávku lékaře (viz Specifické cíle #2, #3 a #4 v Thrasher Foundation Abstract níže; a viz Specifický cíl #4 v NIH, který je jako celek zahrnut ve třech Thrasher Grant na konkrétní cíle).

Studium I. fáze je dokončeno a již nezapisujeme dospělé. Zapisujeme kojence do studií fáze II. Tyto fáze přidáváme postupně na základě doporučení Marthy Jonesové v době, kdy byl náš návrh poprvé předložen IRB. Použili jsme znalosti, které jsme získali ze studií fáze I u dospělých dobrovolníků, abychom provedli úpravy našeho designu studie pro fázi II, která má být provedena u subjektů studie s kojenci, které dostávají klinicky objednané transfuze červených krvinek. Na konci fáze II je zahrnuto zdůvodnění pro zařazení nové srovnávací metody „zlatého standardu“ pro stanovení přežití červených krvinek u kojenců („diferenciální aglutinace, antigenní metoda“). Dokončili jsme zápis všech dospělých předmětů do I. fáze.

ABSTRAKT I (PRO GRANT NADACE THRASHER)

Pozadí:

Anemičtí, kriticky nemocní novorozenci patří mezi nejčastěji transfuzní skupiny pacientů v USA. Odhaduje se, že 130 000 kojenců ročně dostane přibližně 1 000 000 transfuzí červených krvinek. Na rozdíl od dospělých chybí důležitá data týkající se transfuzního přípravku pro optimální přežití červených krvinek u kojenců. K tomuto nedostatku přispívají dvě velké nedávné změny v novorozeneckém krevním bankovnictví a transfuzní praxi. Jedná se o 1) použití transfuzní krve dospělých dárců skladované po dobu až 42 dnů FDA namísto použití pouze krve skladované méně než 7 dnů, jak tomu bylo dříve; a 2) potenciální použití vlastní krve dítěte odebrané z placenty, aby se zabránilo riziku virových infekcí a imunitních transfuzních reakcí z krve dárce. Bohužel neexistují žádné definitivní kojenecké studie, které by se zabývaly těmito změnami přímým měřením přežití červených krvinek. Takové kojenecké studie byly brzděny technickými problémy. Konkrétně musí být údaje o přežití červených krvinek upraveny pro růst, ztrátu laboratorní flebotomie a další transfuze červených krvinek, ale v praxi tomu tak není. Navíc bezpečnostní problémy vylučovaly mnoho studií přežití kojeneckých RBC (např. vystavení radioaktivitě 51Cr a odstranění příliš velkého množství krve dnešním malým, předčasně narozeným dětem). Ve skutečnosti před rokem 1970 (konec používání 51Cr jako označení červených krvinek ve studiích přežití kojeneckých RBC) kojenci vážící při narození méně než 1 500 g často nepřežívali a údaje o přežití červených krvinek neexistují pro dnešní nejmenší kojence, kterým byla nejčastěji podávána transfuze. s porodní hmotností 500-1000 g.

Konkrétní cíle:

Specifický cíl č. 1: Vyvinout in vitro a ověřit in vivo u dospělých schopnost biotinylovat erytrocyty při až 5 diskrétních hustotách, které jsou měřitelné průtokovou cytometrií. Těchto pět značek biotinové hustoty červených krvinek bude použito ve specifických cílech č. 2, 3 a 4 k současnému stanovení přežití červených krvinek u více odlišných populací transfúzních červených krvinek u předčasně narozených dětí.

Konkrétní cíl č. 2. Zjistit, zda přežití červených krvinek dárců a placentárních červených krvinek je významně delší, když je upraveno matematickým modelováním. Předpokládáme, že nemodelované hodnoty podstatně podhodnocují přežití červených krvinek.

Konkrétní cíl č. 3. Porovnat výsledky dlouhodobého přežití červených krvinek u dospělých dárců po transfuzi a fetálních/placentárních červených krvinek u anemických novorozenců. Očekáváme, že rychlejší růst plodů povede k větší stresové erytropoéze vedoucí k vnitřním „defektům“ červených krvinek a zkrácenému přežití červených krvinek ve srovnání s erytrocyty dospělých dárců.

Konkrétní cíl č. 4. Kvantifikovat účinky skladování na modelově upravené přežití RBC dospělých dárců RBC transfundovaných novorozencům. Předpokládáme, že skladování dárcovských červených krvinek nezmění přežití červených krvinek.

Studovat design:

Zde navrhované studie vycházejí z biotinylace a metod matematického modelování, které naše výzkumná skupina vyvinula pro přesné měření přežití červených krvinek bez vystavení dítěte radioaktivitě. Metoda biotinu RBC značení je vhodná pro novorozence, protože umožňuje současné sledování více populací RBC na <10 µl krve. Přežití erytrocytů značených při více biotinových hustotách bude kvantifikováno pomocí standardních parametrů přežití erytrocytů, tj. potransfuzního krátkodobého 24hodinového zotavení RBC a dlouhodobého modelovaného přežití RBC, tj. do 50 a 100 % biotinem značených RBC zmizely z oběhu. Poslední dvě měření budou vypočtena pomocí požadovaných matematických úprav pro růst, ztrátu laboratorní flebotomie a intervenující transfuze červených krvinek.

Jediný specifický cíl č. 4 v abstraktu Thrasher Foundation zahrnuje studijní subjekty s lidskými kojenci. Konkrétní cíl č. 4) POUŽÍVEJTE METODOLOGIE RBC BIOTINYLAČNÍ A MATEMATICKÉ MODELOVÁNÍ VALIDOVANÉ U DOSPĚLÝCH OVCÍ A NOVOROZENÝCH JEHNAT K PŘESNÉMU MĚŘENÍ POSTTRANSFUZNÍ RBC KINETIKY U ANEMICKÝCH NOVOROZENÝCH KOJENCŮ A TRANSFUZOVANÝCH S ČERVNÝM OBČERSTVENÍM. Použití biotinu, netoxického, neradioaktivního vitaminu B, k současnému rozlišení mezi různými populacemi červených krvinek průtokovou cytometrií, je zásadní pro dosažení našich cílů a má jasné výhody oproti jiným metodám značení červených krvinek v bezpečnosti i přesnosti. Při využití čtyř specifických cílů k dosažení našeho cíle, kterým je zavedení účinnějších transfuzních postupů identifikací optimálního transfuzního produktu červených krvinek pro použití u anemických KOJENCŮ.