Sobrevivência de glóbulos vermelhos (RBC) após transfusão em bebês

Fase I: Inclui apenas o objetivo nº 1 do Thrasher Foundation Grant, no qual assuntos adultos serão estudados.

OBJETIVO ESPECÍFICO #1 (Thrasher Foundation Grant): Desenvolver in vitro e validar in vivo em humanos adultos e bebês anêmicos a capacidade de biotinilar hemácias em até 5 densidades discretas para determinar simultaneamente a cinética de hemácias de várias populações distintas de hemácias. Isso requer a expansão da tecnologia de rotulagem de biotina RBC que desenvolvemos anteriormente. Após o refinamento, o método será aplicado nos objetivos subseqüentes conduzidos em lactentes anêmicos recebendo transfusões de hemácias clinicamente ordenadas.

Conforme sugerido por nossos estudos anteriores de sobrevivência de hemácias, prevemos que a marcação mais pesada com biotina alterará as propriedades estruturais intrínsecas das hemácias, encurtando sua sobrevida a longo prazo. Os estudos de validação in vitro e in vivo que propomos em adultos são necessários porque as condições para a obtenção reprodutível de densidades discretas de biotina de hemácias em intervalos apropriados e espaçados não foram conclusivamente elaboradas, nem determinamos empiricamente qual das cinco densidades não será artificialmente encurtar a sobrevida dos eritrócitos a longo prazo. Podemos usar as densidades mais leves para medições de sobrevivência de hemácias e as densidades mais pesadas para medições simultâneas de volume de hemácias necessárias para contabilizar os aumentos de volume de hemácias causados ​​pelo crescimento. É importante realizar esses estudos de viabilidade em adultos e bebês por causa dos estados fisiológicos muito diferentes, ou seja, adultos normais e saudáveis ​​estão em eritropoiese em estado estacionário, enquanto bebês anêmicos gravemente doentes experimentam múltiplas circunstâncias clínicas que perturbam a sobrevivência de hemácias, por exemplo, crescimento , flebotomia, transfusão interveniente, etc.

Além da marcação com biotina do método de hemácias, o "método de aglutinação diferencial, antigênica" usando citometria de fluxo será aplicado para lactentes que recebem transfusões alogênicas de hemácias. Os resultados dos dois métodos serão comparados entre si. O método de aglutinação diferencial utiliza diferenças nos antígenos de superfície das hemácias entre o doador e o receptor para determinar a sobrevida das hemácias a curto e longo prazo. Os resultados da genotipagem de antígenos de hemácias de doadores adultos e receptores infantis (realizados no Mississippi Valley Regional Blood Center) permitem a identificação de pequenas diferenças de grupos sanguíneos entre hemácias doadoras e receptoras, de modo que os anticorpos de hemácias menores adequadamente rotulados (disponíveis comercialmente e usados ​​por bancos de sangue para menores tipagem de grupo sanguíneo RBC) pode ser usado na determinação por citometria de fluxo da sobrevivência de RBC. A sobrevivência de RBC determinada para cada um dos marcadores de biotina e para as diferenças antigênicas de RBC serão todas comparadas entre si. O método de aglutinação diferencial/antígeno será considerado o "padrão ouro", pois as hemácias são marcadas ex-vivo, APÓS a transfusão de hemácias, sem modificar as proteínas da superfície da membrana das hemácias como a biotinilação faz. Nossa hipótese é que a adição de muita biotina pode levar a uma sobrevida de hemácias in vivo artificialmente reduzida, mas que doses mais baixas de biotina não. Ao incluir também os resultados de sobrevivência de hemácias do método de aglutinação diferencial/antígeno, seremos capazes de validar melhor nossa hipótese de biotina multidensidade.

Nosso objetivo geral nesta pesquisa é melhorar as práticas de transfusão de glóbulos vermelhos (RBC) para bebês anêmicos gravemente doentes. Este projeto recebeu o apoio de duas agências financiadoras: 1) The Thrasher Foundation, intitulado "Recuperação e Sobrevivência de Glóbulos Vermelhos Após Transfusão em Lactentes"; e 2) NIH PPG Grant P01 HL046925, Projeto 1 intitulado "Sobrevivência de glóbulos vermelhos após transfusão em bebês". Resumos para ambos estão incluídos abaixo. Este projeto será realizado em duas fases:

A Fase I inclui estudos de hemácias biotiniladas autólogas transfundidas em voluntários humanos adultos saudáveis ​​normais (consulte o Objetivo Específico nº 1 no Resumo da Fundação Thrasher abaixo); e

A Fase II inclui estudos de bebês que requerem transfusões de glóbulos vermelhos por ordem médica (consulte os objetivos específicos nº 2, nº 3 e nº 4 no Resumo da Thrasher Foundation abaixo; e consulte o Objetivo específico nº 4 do NIH, que está incluído em sua totalidade nos três Thrasher Foundation Conceder objetivos específicos).

Os estudos da Fase I estão concluídos e não estamos mais matriculando adultos. Estamos inscrevendo bebês para estudos de Fase II. Estamos adicionando essas fases sequencialmente com base na recomendação de Martha Jones no momento em que nossa proposta foi submetida pela primeira vez ao IRB. Aplicamos o conhecimento que adquirimos nos estudos de Fase I em voluntários adultos para fazer modificações em nosso desenho de estudo para a Fase II a ser realizada em bebês que receberam transfusões de hemácias clinicamente solicitadas. No final da Fase II, é incluída a justificativa para a inclusão de um novo método de comparação "padrão-ouro" para determinar a sobrevivência de hemácias em bebês (o "método antigênico de aglutinação diferencial"). Concluímos a inscrição de todas as disciplinas adultas para a fase I.

RESUMO I (PARA CONCESSÃO DA FUNDAÇÃO THRASHER)

Fundo:

Recém-nascidos anêmicos e criticamente doentes estão entre os grupos de pacientes que recebem mais transfusões nos Estados Unidos. Estima-se que 130.000 bebês recebam anualmente aproximadamente 1.000.000 transfusões de hemácias. Ao contrário dos adultos, faltam dados importantes sobre o produto de transfusão para uma sobrevivência ideal de hemácias em lactentes. Contribuindo para essa falta estão duas grandes mudanças recentes nos bancos de sangue neonatal e nas práticas de transfusão. Estes são 1) o uso de sangue de doador adulto transfundido armazenado até o limite de 42 dias do FDA, em vez de apenas usar sangue armazenado por menos de 7 dias, como havia sido feito anteriormente; e 2) uso potencial do sangue do próprio bebê colhido da placenta para evitar os riscos de infecções virais e reações imunes à transfusão de sangue doado. Infelizmente, não há estudos infantis definitivos que abordem essas alterações medindo diretamente a sobrevida dos eritrócitos. Tais estudos infantis foram prejudicados por problemas técnicos. Especificamente, os dados de sobrevida de hemácias devem ser ajustados para crescimento, perda de flebotomia laboratorial e transfusões adicionais de hemácias intervenientes, mas na prática isso não acontece. Além disso, questões de segurança impediram muitos estudos de sobrevivência de hemácias infantis (por exemplo, exposição à radioatividade 51Cr e remoção de muito sangue dos bebês prematuros de hoje). De fato, antes de 1970 (o fim do uso de 51Cr como um marcador de hemácias em estudos de sobrevivência de hemácias infantis), os bebês com peso inferior a 1.500 g ao nascer muitas vezes não sobreviviam, e os dados de sobrevivência de hemácias não existem para os bebês menores e mais frequentemente transfundidos de hoje cujos pesos ao nascer são 500-1.000 g.

Objetivos Específicos:

Objetivo específico nº 1: Desenvolver in vitro e validar in vivo em adultos a capacidade de biotinilar hemácias em até 5 densidades discretas mensuráveis ​​por citometria de fluxo. Esses cinco rótulos de densidade de biotina de hemácias serão usados ​​nos objetivos específicos nº 2, 3 e 4 para determinar simultaneamente a sobrevivência de hemácias de populações múltiplas e distintas de hemácias transfundidas em bebês prematuros.

Objetivo Específico #2. Determinar se a sobrevida de hemácias de doadores e hemácias placentárias é significativamente maior quando ajustada por modelagem matemática. Prevemos que os valores não modelados subestimam substancialmente a sobrevivência de RBC.

Objetivo Específico #3. Comparar os resultados de sobrevida de hemácias a longo prazo para doadores adultos transfundidos e hemácias fetais/placentárias em recém-nascidos anêmicos. Prevemos que um crescimento mais rápido em fetos resultará em maior eritropoiese de estresse, levando a "defeitos" intrínsecos de hemácias e menor sobrevida de hemácias em comparação com hemácias de doadores adultos.

Objetivo Específico #4. Quantificar os efeitos do armazenamento na sobrevivência de hemácias ajustadas ao modelo de hemácias de doadores adultos transfundidas em recém-nascidos. Prevemos que o armazenamento de hemácias de doadores não alterará a sobrevivência de hemácias.

Design de estudo:

Os estudos propostos aqui baseiam-se em métodos de biotinilação e modelagem matemática que nosso grupo de pesquisa desenvolveu para medir com precisão a sobrevivência de hemácias sem expor o bebê à radioatividade. O método de rotulagem de hemácias com biotina é adequado para recém-nascidos porque permite o rastreamento simultâneo de várias populações de hemácias em <10 µl de sangue. A sobrevivência de hemácias marcadas em múltiplas densidades de biotina será quantificada usando os parâmetros de sobrevivência de hemácias padrão, ou seja, recuperação de hemácias pós-transfusão de curto prazo em 24 h e sobrevivência de hemácias modeladas de longo prazo, ou seja, até 50 e 100% de hemácias marcadas com biotina desapareceram da circulação. As duas últimas medições serão calculadas usando os ajustes matemáticos necessários para crescimento, perda de flebotomia laboratorial e transfusões de hemácias intervenientes.

Apenas o Objetivo Específico nº 4 no Resumo da Fundação Thrasher envolve sujeitos de estudo de bebês humanos. Objetivo Específico #4) USAR AS METODOLOGIAS DE BIOTINILAÇÃO DE RBC E DE MODELAGEM MATEMÁTICA VALIDADAS EM OVELHAS ADULTAS E CORDEIROS RECÉM-NASCIDOS PARA MEDIR COM PRECISÃO A CINÉTICA DE RBC PÓS-TRANSFUSÃO EM RECÉM-NASCIDOS ANÊMICOS TRANSFUNDIDOS COM GV AUTÓLOGO FRESCO, ALOGÊNICO FRESCO E ALOGÊNICO CONSERVADO. O uso de biotina, uma vitamina B não tóxica e não radioativa, para distinguir entre diferentes populações de hemácias simultaneamente por citometria de fluxo é fundamental para atingir nossos objetivos e possui vantagens claras sobre outros métodos de rotulagem de hemácias em segurança e precisão. Ao utilizar os quatro Objetivos Específicos para atingir nosso objetivo de estabelecer práticas de transfusão mais eficazes, identificando o produto de transfusão de hemácias ideal para uso em BEBÊS anêmicos.