Punasolujen (RBC) selviytyminen imeväisten verensiirron jälkeen

Vaihe I: Sisältää vain tavoitteen nro 1 Thrasher Foundation Grantista, jossa opiskellaan aikuisten aineita.

ERITYISTAVOITE #1 (Thrasher Foundation Grant): Kehittää in vitro ja validoida in vivo aikuisilla ihmisillä ja aneemisilla imeväisillä kyky biotinyloida punasoluja jopa viidellä eri tiheydellä, jotta voidaan määrittää samanaikaisesti useiden erillisten punasolujen kinetiikka. Tämä edellyttää aiemmin kehittämämme punasolujen biotiinimerkintäteknologian laajentamista. Jalostamisen jälkeen menetelmää sovelletaan myöhemmissä tavoitteissa, jotka suoritetaan aneemisilla vauvoilla, jotka saavat kliinisesti määrättyjä punasolusiirtoja.

Kuten aikaisemmat punasolujen eloonjäämistutkimuksemme ehdottivat, oletamme, että raskain biotiinimerkintä muuttaa punasolujen sisäisiä punasolujen rakenteellisia ominaisuuksia, mikä lyhentää niiden pitkän aikavälin eloonjäämistä. Ehdottamamme aikuisilla tehdyt in vitro- ja in vivo -validointitutkimukset ovat välttämättömiä, koska olosuhteita erillisten punasolujen biotiinitiheyksien saamiseksi toistettavasti sopivin, tiiviin väliajoin ei ole lopullisesti selvitetty, emmekä ole määrittäneet empiirisesti, mikä viidestä tiheydestä ei artefaktisesti tee. lyhentää punasolujen pitkän aikavälin eloonjäämistä. Voimme käyttää kevyempiä tiheyksiä punasolujen eloonjäämismittauksiin ja raskaampia tiheyksiä samanaikaisiin punasolujen tilavuuden mittauksiin, joita tarvitaan kasvun aiheuttaman punasolujen tilavuuden kasvun huomioon ottamiseksi. On tärkeää suorittaa nämä toteutettavuustutkimukset sekä aikuisilla että pikkulapsilla, koska fysiologiset tilat ovat hyvin erilaisia, eli normaalit, terveet aikuiset ovat vakaan tilan erytropoieesissa, kun he ovat kriittisesti sairaita, aneemisilla imeväisillä on useita kliinisiä olosuhteita, jotka häiritsevät punasolujen eloonjäämistä, esim. kasvua. , flebotomia, väliaikainen verensiirto jne.

RBC-menetelmän biotiinileimauksen lisäksi allogeenisiä punasolusiirtoja saaville vauvoille sovelletaan virtaussytometriaa käyttävää "differentiaalista agglutinaatio-antigeenimenetelmää". Näiden kahden menetelmän tuloksia verrataan keskenään. Differentiaalinen agglutinaatiomenetelmä hyödyntää punasolujen pinta-antigeenien eroja luovuttajan ja vastaanottajan välillä punasolujen lyhyt- ja pitkän aikavälin eloonjäämisen määrittämiseksi. Aikuisten luovuttajien ja vastasyntyneiden punasolujen antigeenien genotyypitystulokset (suoritettu Mississippi Valleyn alueellisessa verikeskuksessa) mahdollistavat pienten veriryhmien erojen tunnistamisen luovuttajan ja vastaanottajan punasolujen välillä, jotta saadaan asianmukaisesti leimattuja pieniä punasolujen vasta-aineita (saatavilla kaupallisesti ja veripankkien käyttämät alaikäisten punasolujen välillä veriryhmän punasolujen tyypitys) voidaan käyttää punasolujen eloonjäämisen virtaussytometriseen määritykseen. Punasolujen eloonjäämistä, joka on määritetty kullekin biotiinileimalle ja RBC-antigeenierille, verrataan keskenään. Differentiaalista agglutinaatio/antigeenimenetelmää pidetään "kultastandardina", koska punasolut on leimattu ex vivo, RBC-siirron JÄLKEEN, jolloin ei muuteta punasolujen kalvon pintaproteiineja, kuten biotinylaatio tekee. Hypoteesimme on, että liian suuren biotiinin lisääminen voi johtaa artefaktaalisesti lyhentyneeseen punasolujen eloonjäämiseen in vivo, mutta pienemmät biotiiniannokset eivät. Sisällyttämällä myös differentiaalista agglutinaatio-/antigeenimenetelmää koskevat punasolujen eloonjäämistulokset, voimme vahvistaa monitiheysbiotiinihypoteesimme paremmin.

Tämän tutkimuksen yleistavoitteemme on parantaa punasolujen (RBC) siirtokäytäntöjä aneemisille, kriittisesti sairaille vauvoille. Tämä hanke on saanut tukea kahdelta myöntäjävirastolta: 1) Thrasher Foundation, jonka otsikko on "Punasolujen palautuminen ja selviytyminen verensiirron jälkeen pikkulapsilla"; ja 2) NIH PPG Grant P01 HL046925, projekti 1, jonka otsikkona on "Punasolujen selviytyminen verensiirron jälkeen pikkulapsilla". Molempien tiivistelmät ovat alla. Tämä projekti valmistuu kahdessa vaiheessa:

Vaihe I sisältää tutkimukset autologisista biotinyloiduista punasoluista, jotka on siirretty normaaleille terveille aikuisille vapaaehtoisille ihmisille (katso Thrasher Foundation Abstractin erityistavoite #1 alla); ja

Vaihe II sisältää tutkimuksia pikkulapsista, jotka edellyttävät lääkärin määräämiä punasolujen siirtoja (katso erityistavoitteet #2, #3 ja #4 Thrasher Foundation Abstractissa alla; ja katso Special Aim #4 NIH:ssa, joka sisältyy kokonaisuudessaan kolmeen Thrasheriin myöntää erityisiä tavoitteita).

Vaiheen I opinnot ovat päättyneet, emmekä ota enää aikuisia. Ilmoitamme vauvoja vaiheen II tutkimuksiin. Lisäämme nämä vaiheet peräkkäin Martha Jonesin suosituksen perusteella, kun ehdotuksemme toimitettiin ensimmäisen kerran IRB:lle. Olemme soveltaneet aikuisilla vapaaehtoisilla tehdyistä vaiheen I tutkimuksista saamiamme tietoja muuttaaksemme tutkimussuunnitelmaamme faasi II:lle, joka suoritetaan pikkulapsille, jotka saavat kliinisesti määrättyjä punasolusiirtoja. Vaiheen II lopussa perustelut uuden vertailevan "kultastandardin" menetelmän sisällyttämiselle imeväisten punasolujen eloonjäämisen määrittämiseen ("differentiaalinen agglutinaatio, antigeenimenetelmä") on sisällytetty. Olemme saaneet päätökseen kaikkien aikuisten aineiden ilmoittautumisen vaiheeseen I.

TIIVISTELMÄ I (THRASHER-SÄÄTIÖAPURAHA)

Tausta:

Aneemiset, kriittisesti sairaat vastasyntyneet ovat yksi yleisimmin verensiirron saaneista potilasryhmistä Yhdysvalloissa. Arviolta 130 000 vauvaa saa vuosittain noin 1 000 000 punasolujen siirtoa. Toisin kuin aikuisilla, verensiirtotuotteesta puuttuu tärkeitä tietoja imeväisten optimaalisen punasolujen eloonjäämisen kannalta. Tähän puutteeseen vaikuttavat kaksi suurta viimeaikaista muutosta vastasyntyneiden veripankki- ja verensiirtokäytännöissä. Näitä ovat 1) FDA:n 42 päivän rajaan asti säilytetyn aikuisen luovuttajan veren käyttö sen sijaan, että käytettäisiin vain alle 7 päivää varastoitua verta, kuten aiemmin; ja 2) imeväisen istukasta kerätyn oman veren mahdollinen käyttö virusinfektioiden ja luovuttajaveren immuunisiirtoreaktioiden riskien välttämiseksi. Valitettavasti ei ole olemassa lopullisia pikkulasten tutkimuksia, jotka käsittelevät näitä muutoksia mittaamalla suoraan punasolujen eloonjäämistä. Tällaisia ​​pikkulasten opintoja ovat haitanneet tekniset ongelmat. Erityisesti punasolujen eloonjäämistiedot on mukautettava kasvun, laboratorioflebotomian menetyksen ja väliin tulevien punasolujen lisäsiirtojen mukaan, mutta käytännössä niitä ei ole tehty. Lisäksi turvallisuuskysymykset ovat estäneet monet pikkulasten punasolujen eloonjäämistutkimukset (esim. altistuminen 51Cr-radioaktiivisuudelle ja liian suuren veren poistaminen nykypäivän pienistä, keskosista). Itse asiassa ennen vuotta 1970 (51Cr:n käytön lopettaminen RBC-leimana pikkulasten punasolujen eloonjäämistutkimuksissa) alle 1500 g painoiset lapset eivät usein selvinneet hengissä, eikä punasolujen eloonjäämistietoja ole nykypäivän pienimmistä, useimmin verensiirron saaneista vauvoista. joiden syntymäpaino on 500-1000 g.

Erityiset tavoitteet:

Erityinen tavoite #1: Kehittää in vitro ja validoida in vivo aikuisten kyky biotinyloida punasoluja jopa viidellä erillisellä tiheydellä, jotka ovat mitattavissa virtaussytometrillä. Näitä viittä punasolujen biotiinitiheysleimaa käytetään erityisissä tavoitteissa 2, 3 ja 4 määrittämään samanaikaisesti useiden erillisten verensiirron saaneiden punasolujen populaatioiden punasolujen eloonjääminen keskosilla.

Erityinen tavoite #2. Sen määrittämiseksi, onko luovuttajien ja istukan punasolujen eloonjääminen merkittävästi pidempi matemaattisella mallinnuksella säädettynä. Odotamme, että mallintamattomat arvot aliarvioivat oleellisesti punasolujen eloonjäämisen.

Erityinen tavoite #3. Vertaamalla verensiirtoa saaneiden aikuisten luovuttajien ja sikiön/istukan punasolujen pitkän aikavälin eloonjäämistuloksia aneemisilla vastasyntyneillä. Odotamme, että sikiöiden nopeampi kasvu johtaa suurempaan stressierytropoieesiin, mikä johtaa sisäisiin punasolujen "virheisiin" ja lyhentyneeseen punasolujen eloonjäämiseen verrattuna aikuisten luovuttajien punasoluihin.

Erityinen tavoite #4. Säilytyksen vaikutusten kvantifiointi vastasyntyneisiin vauvoille siirrettyjen aikuisten luovuttajien punasolujen eloonjäämiseen mallisovitettuun punasoluihin. Odotamme, että luovuttajien punasolujen varastointi ei muuta punasolujen eloonjäämistä.

Opintosuunnitelma:

Tässä ehdotetut tutkimukset perustuvat biotinylaatioon ja matemaattisiin mallinnusmenetelmiin, jotka tutkimusryhmämme on kehittänyt punasolujen eloonjäämisen tarkkaan mittaamiseen ilman, että vauva altistuu radioaktiivisuudelle. Biotiinin punasolujen leimausmenetelmä sopii hyvin vastasyntyneille, koska se mahdollistaa useiden punasolujen samanaikaisen seurannan <10 µl:sta verta. Useilla biotiinitiheyksillä leimattujen punasolujen eloonjääminen kvantifioidaan käyttämällä standardeja punasolujen eloonjäämisparametreja, eli verensiirron jälkeistä lyhytaikaista 24 tunnin punasolujen eloonjäämistä ja pitkän aikavälin mallinnettua punasolujen eloonjäämistä, eli 50 % ja 100 % biotiinilla leimatuista punasoluista. ovat kadonneet liikkeistä. Kaksi jälkimmäistä mittausta lasketaan käyttämällä tarvittavia matemaattisia säätöjä kasvun, laboratorioflebotomian menetyksen ja punasolujen välissä tapahtuvan verensiirron kannalta.

Vain Thrasher Foundation Abstractin erityistavoite nro 4 koskee ihmislapsitutkimuskohteita. Erityinen tavoite #4) KÄYTÄ AIKUISILLE LAMPAILLE JA VASTASYNTYNYNEILLE VALIDISTETTUJA RBC-BIOTINYLAATIO- JA MATEMAATTISTA MALLINNUSMENETELMIÄ MITTAASI TARKKAAN LIIKEVERKON JÄLKEISEN RBC-KINETIIKAN ANEEMISESSA, AUTOM. Biotiinin, myrkyttömän, ei-radioaktiivisen B-vitamiinin, käyttö eri RBC-populaatioiden erottamiseen samanaikaisesti virtaussytometrian avulla on kriittistä tavoitteidemme saavuttamiseksi, ja sillä on selkeitä etuja muihin punasolujen merkintämenetelmiin verrattuna sekä turvallisuuden että tarkkuuden osalta. Hyödyntämällä neljää erityistä tavoitetta saavuttaaksemme tavoitteemme luoda tehokkaampia verensiirtokäytäntöjä tunnistamalla optimaalinen punasolujen siirtotuote käytettäväksi aneemisissa IMEVUOSISSA.