Sopravvivenza dei globuli rossi (RBC) dopo la trasfusione nei neonati

Fase I: include solo l'obiettivo n. 1 della sovvenzione della Thrasher Foundation in cui verranno studiate materie per adulti.

OBIETTIVO SPECIFICO #1 (Thrasher Foundation Grant): Sviluppare in vitro e convalidare in vivo negli esseri umani adulti e nei neonati anemici la capacità di biotinilare i globuli rossi fino a 5 densità discrete per determinare simultaneamente la cinetica dei globuli rossi di popolazioni multiple e distinte di globuli rossi. Ciò richiede l'espansione della tecnologia di etichettatura della biotina RBC che abbiamo precedentemente sviluppato. Dopo il perfezionamento, il metodo sarà applicato nei successivi obiettivi condotti in neonati anemici che ricevono trasfusioni di RBC ordinate clinicamente.

Come suggerito dai nostri precedenti studi sulla sopravvivenza dei globuli rossi, prevediamo che l'etichettatura più pesante della biotina altererà le proprietà strutturali intrinseche dei globuli rossi, accorciando la loro sopravvivenza a lungo termine. Gli studi di convalida in vitro e in vivo che proponiamo negli adulti sono necessari perché le condizioni per ottenere in modo riproducibile densità discrete di biotina RBC a intervalli appropriati e ravvicinati non sono state elaborate in modo definitivo, né abbiamo determinato empiricamente quale delle cinque densità non sarà artefatta ridurre la sopravvivenza a lungo termine dei globuli rossi. Possiamo utilizzare le densità più leggere per le misurazioni della sopravvivenza dei globuli rossi e le densità più pesanti per le misurazioni simultanee del volume dei globuli rossi necessarie per tenere conto degli aumenti del volume dei globuli rossi causati dalla crescita. È importante eseguire questi studi di fattibilità sia negli adulti che nei neonati a causa degli stati fisiologici molto diversi, ad esempio, gli adulti normali e sani sono in eritropoiesi allo stato stazionario mentre i bambini gravemente malati e anemici sperimentano molteplici circostanze cliniche che perturbano la sopravvivenza dei globuli rossi, ad esempio, la crescita , flebotomia, trasfusioni intermedie, ecc.

Oltre alla marcatura con biotina del metodo RBC, verrà applicato il "metodo di agglutinazione differenziale, antigenico" utilizzando la citometria a flusso per i neonati che ricevono trasfusioni allogeniche di RBC. I risultati dei due metodi saranno confrontati tra loro. Il metodo di agglutinazione differenziale utilizza le differenze negli antigeni di superficie dei globuli rossi tra il donatore e il ricevente per determinare la sopravvivenza dei globuli rossi a breve e lungo termine. I risultati della genotipizzazione degli antigeni RBC del donatore adulto e del ricevente neonato (eseguiti presso il Mississippi Valley Regional Blood Center) consentono l'identificazione di piccole differenze di gruppo sanguigno tra RBC del donatore e del ricevente in modo che gli anticorpi RBC minori opportunamente etichettati (disponibili in commercio e utilizzati dalle banche del sangue per minori tipizzazione dei gruppi sanguigni dei globuli rossi) può essere utilizzato nella determinazione citometrica a flusso della sopravvivenza dei globuli rossi. La sopravvivenza RBC determinata per ciascuna delle etichette di biotina e per le differenze antigeniche RBC saranno tutte confrontate tra loro. Il metodo dell'agglutinazione differenziale/antigene sarà considerato il "gold standard" in quanto i globuli rossi vengono marcati ex-vivo, DOPO la trasfusione di globuli rossi, quindi senza modificare le proteine ​​di superficie della membrana dei globuli rossi come fa la biotinilazione. La nostra ipotesi è che l'aggiunta di troppa biotina possa portare a una sopravvivenza dei globuli rossi in vivo accorciata artificialmente, ma che dosi inferiori di biotina non lo facciano. Includendo anche i risultati di sopravvivenza RBC del metodo di agglutinazione differenziale/antigene, saremo in grado di convalidare meglio la nostra ipotesi sulla biotina multi-densità.

Il nostro obiettivo generale in questa ricerca è migliorare le pratiche di trasfusione di globuli rossi (RBC) per i neonati anemici e in condizioni critiche. Questo progetto ha ricevuto il sostegno di due enti finanziatori: 1) The Thrasher Foundation, dal titolo "Red Blood Cell Recovery and Survival After Transfusion in Infants"; e 2) NIH PPG Grant P01 HL046925, Progetto 1 intitolato "Sopravvivenza dei globuli rossi dopo la trasfusione nei neonati". Di seguito sono riportati gli abstract di entrambi. Questo progetto sarà completato in due fasi:

La fase I include studi sui globuli rossi biotinilati autologhi trasfusi in volontari umani adulti sani (vedere l'obiettivo specifico n. 1 nell'estratto della Thrasher Foundation di seguito); E

La fase II include studi su neonati che richiedono trasfusioni di globuli rossi su prescrizione medica (vedere gli obiettivi specifici n. 2, n. 3 e n. Concedere finalità specifiche).

Gli studi di Fase I sono stati completati e non stiamo più iscrivendo adulti. Stiamo arruolando neonati per gli studi di Fase II. Stiamo aggiungendo queste fasi in sequenza sulla base della raccomandazione di Martha Jones al momento in cui la nostra proposta è stata presentata per la prima volta all'IRB. Abbiamo applicato le conoscenze che abbiamo acquisito dagli studi di Fase I su soggetti volontari adulti per apportare modifiche al nostro disegno di studio per la Fase II da eseguire in soggetti di studio infantili che ricevono trasfusioni di RBC ordinate clinicamente. Alla fine della Fase II, viene inclusa la giustificazione per l'inclusione di un nuovo metodo di confronto "gold standard" per determinare la sopravvivenza dei globuli rossi nei neonati (l'"agglutinazione differenziale, metodo antigenico"). Abbiamo completato l'arruolamento di tutti i soggetti adulti per la fase I.

ABSTRACT I (PER BORSA DI STUDIO THRESHER FOUNDATION)

Sfondo:

I neonati anemici e gravemente malati sono tra i gruppi di pazienti trasfusi più frequentemente negli Stati Uniti. Si stima che circa 130.000 neonati ogni anno ricevano circa 1.000.000 di trasfusioni di globuli rossi. A differenza degli adulti, mancano dati importanti sul prodotto trasfusionale per una sopravvivenza ottimale dei globuli rossi nei neonati. A contribuire a questa mancanza sono due importanti recenti cambiamenti nelle banche del sangue neonatale e nelle pratiche trasfusionali. Questi sono 1) l'uso di sangue di donatore adulto trasfuso conservato fino al limite di 42 giorni della FDA invece di utilizzare solo sangue conservato per meno di 7 giorni come era stato fatto in precedenza; e 2) uso potenziale del sangue del bambino prelevato dalla placenta per evitare i rischi di infezioni virali e reazioni trasfusionali immunitarie dal sangue del donatore. Sfortunatamente, non esistono studi infantili definitivi che affrontino questi cambiamenti misurando direttamente la sopravvivenza dei globuli rossi. Tali studi infantili sono stati ostacolati da problemi tecnici. In particolare, i dati sulla sopravvivenza dei globuli rossi devono essere aggiustati per la crescita, la perdita di flebotomia di laboratorio e l'intervento di ulteriori trasfusioni di globuli rossi, ma in pratica non lo sono. Inoltre, i problemi di sicurezza hanno precluso molti studi sulla sopravvivenza dei globuli rossi nei neonati (ad esempio, l'esposizione alla radioattività 51Cr e la rimozione di troppo sangue dai piccoli neonati prematuri di oggi). In effetti, prima del 1970 (la fine dell'uso del 51Cr come etichetta RBC negli studi sulla sopravvivenza RBC infantile), i bambini che pesavano meno di 1.500 g alla nascita non sopravvivevano spesso e non esistono dati sulla sopravvivenza RBC per i bambini più piccoli e più frequentemente trasfusi di oggi il cui peso alla nascita è di 500-1.000 g.

Obiettivi specifici:

Obiettivo specifico n. 1: sviluppare in vitro e convalidare in vivo negli adulti la capacità di biotinilare i globuli rossi fino a 5 densità discrete misurabili mediante citometria a flusso. Queste cinque etichette di densità di biotina RBC saranno utilizzate negli obiettivi specifici n. 2, 3 e 4 per determinare simultaneamente la sopravvivenza RBC di popolazioni multiple e distinte di RBC trasfusi nei neonati prematuri.

Obiettivo specifico n. 2. Per determinare se la sopravvivenza dei globuli rossi del donatore e dei globuli rossi della placenta è significativamente più lunga se aggiustata mediante modelli matematici. Prevediamo che i valori non modellati sottostimino sostanzialmente la sopravvivenza dei globuli rossi.

Obiettivo specifico n. 3. Per confrontare i risultati di sopravvivenza a lungo termine dei globuli rossi per donatore adulto trasfuso e globuli rossi fetali/placentari nei neonati anemici. Prevediamo che una crescita più rapida nei feti si tradurrà in una maggiore eritropoiesi da stress che porta a "difetti" intrinseci dei globuli rossi e una ridotta sopravvivenza dei globuli rossi rispetto ai globuli rossi dei donatori adulti.

Obiettivo specifico n. 4. Quantificare gli effetti dell'immagazzinamento sulla sopravvivenza dei globuli rossi aggiustata per modello di globuli rossi di donatori adulti trasfusi nei neonati. Prevediamo che la conservazione dei globuli rossi del donatore non altererà la sopravvivenza dei globuli rossi.

Disegno dello studio:

Gli studi qui proposti si basano sulla biotinilazione e sui metodi di modellazione matematica che il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato per misurare accuratamente la sopravvivenza dei globuli rossi senza esporre il bambino alla radioattività. Il metodo di etichettatura dei globuli rossi con biotina è adatto ai neonati perché consente il monitoraggio simultaneo di più popolazioni di globuli rossi su <10 µL di sangue. La sopravvivenza dei globuli rossi marcati con densità multiple di biotina sarà quantificata utilizzando i parametri standard di sopravvivenza dei globuli rossi, ovvero il recupero dei globuli rossi a breve termine post-trasfusione nelle 24 ore e la sopravvivenza dei globuli rossi modellata a lungo termine, ovvero fino al 50 e 100% dei globuli rossi marcati con biotina sono scomparse dalla circolazione. Le ultime due misurazioni saranno calcolate utilizzando gli aggiustamenti matematici richiesti per la crescita, la perdita di flebotomia di laboratorio e le trasfusioni di RBC intermedie.

Solo l'obiettivo specifico n. 4 nell'estratto della Fondazione Thrasher coinvolge soggetti di studio su neonati umani. Obiettivo specifico #4) UTILIZZARE LE METODOLOGIE DI BIOTINYLATION E DI MODELLAZIONE MATEMATICA RBC VALIDATE IN OVINI ADULTI E AGNELLI NEONATI PER MISURARE ACCURATAMENTE LA CINETICA DEI GR POST-TRASFUSIONALI NEI NEONATI ANEMICI TRASFUSI CON GR FRESCHI AUTOLOGHI, ALLOGENEICI FRESCHI E CONSERVATI. L'uso della biotina, una vitamina B non tossica e non radioattiva, per distinguere simultaneamente diverse popolazioni di globuli rossi mediante citometria a flusso è fondamentale per raggiungere i nostri obiettivi e presenta chiari vantaggi rispetto ad altri metodi di etichettatura dei globuli rossi sia in termini di sicurezza che di accuratezza. Nell'utilizzare i quattro obiettivi specifici per raggiungere il nostro obiettivo di stabilire pratiche trasfusionali più efficaci identificando il prodotto trasfusionale ottimale per l'uso nei NEONATI anemici.