Przeżywalność krwinek czerwonych (RBC) po transfuzji u niemowląt

Faza I: obejmuje tylko cel nr 1 z grantu Thrasher Foundation, w ramach którego będą badane osoby dorosłe.

CEL SZCZEGÓŁOWY NR 1 (grant Fundacji Thrashera): Opracowanie in vitro i walidacja in vivo u dorosłych ludzi i niemowląt z anemią zdolności biotynylowania erytrocytów w maksymalnie 5 odrębnych gęstościach w celu jednoczesnego określenia kinetyki erytrocytów wielu odrębnych populacji erytrocytów. Wymaga to rozszerzenia technologii znakowania biotyną RBC, którą wcześniej opracowaliśmy. Po udoskonaleniu metoda będzie stosowana w kolejnych celach prowadzonych u niemowląt z anemią otrzymujących klinicznie zlecone transfuzje krwinek czerwonych.

Jak sugerują nasze poprzednie badania przeżycia RBC, przewidujemy, że najcięższe znakowanie biotyną zmieni wewnętrzne właściwości strukturalne RBC RBC, skracając ich długoterminowe przeżycie. Badania walidacyjne in vitro i in vivo, które proponujemy u dorosłych, są konieczne, ponieważ warunki powtarzalnego uzyskiwania dyskretnych gęstości biotyny RBC w odpowiednich, blisko rozmieszczonych odstępach czasu nie zostały ostatecznie opracowane, ani nie ustaliliśmy empirycznie, która z pięciu gęstości nie będzie artefaktycznie skrócić długoterminowe przeżycie RBC. Możemy użyć mniejszych gęstości do pomiarów przeżycia RBC, a większych gęstości do jednoczesnych pomiarów objętości RBC potrzebnych do uwzględnienia wzrostu objętości RBC spowodowanego wzrostem. Ważne jest, aby przeprowadzić te studia wykonalności zarówno u dorosłych, jak i niemowląt ze względu na bardzo różne stany fizjologiczne, tj. normalni, zdrowi dorośli są w stanie ustalonej erytropoezy, podczas gdy krytycznie chore niemowlęta z niedokrwistością doświadczają wielu okoliczności klinicznych, które zaburzają przeżycie RBC, np. , flebotomia, interwencyjna transfuzja itp.

Oprócz znakowania biotyną metodą RBC, u niemowląt otrzymujących allogeniczne transfuzje krwinek czerwonych stosowana będzie „aglutynacja różnicowa, metoda antygenowa” z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Wyniki obu metod zostaną ze sobą porównane. Metoda różnicowej aglutynacji wykorzystuje różnice w antygenach powierzchniowych czerwonych krwinek między dawcą a biorcą w celu określenia krótko- i długoterminowego przeżycia czerwonych krwinek. Wyniki genotypowania antygenów RBC dorosłego dawcy i niemowlęcia biorcy (wykonane w Regionalnym Centrum Krwiodawstwa Doliny Mississippi) pozwalają na identyfikację niewielkich różnic między grupami krwi dawcy i biorcy RBC, tak aby odpowiednio oznakowane przeciwciała RBC drugorzędne (dostępne w handlu i stosowane przez banki krwi dla mniejszych oznaczanie grupy krwi RBC) może być wykorzystane w cytometrii przepływowej do określania przeżywalności czerwonych krwinek. Przeżycie RBC określone dla każdego ze znaczników biotyny i różnic antygenowych RBC zostanie porównane między sobą. Różnicowa metoda aglutynacji/antygenu będzie uważana za „złoty standard”, ponieważ krwinki czerwone są znakowane ex vivo, PO transfuzji krwinek czerwonych, a zatem bez modyfikowania białek powierzchniowych błony czerwonych krwinek, jak ma to miejsce w przypadku biotynylacji. Nasza hipoteza jest taka, że ​​dodanie zbyt dużej ilości biotyny może prowadzić do sztucznego skrócenia przeżycia RBC in vivo, ale niższe dawki biotyny nie. Uwzględniając również wyniki przeżycia RBC metodą różnicowej aglutynacji / antygenu, będziemy w stanie lepiej zweryfikować naszą hipotezę biotyny o wielu gęstościach.

Naszym ogólnym celem w tych badaniach jest poprawa praktyk transfuzji krwinek czerwonych (RBC) u krytycznie chorych niemowląt z niedokrwistością. Projekt ten otrzymał wsparcie od dwóch agencji grantowych: 1) Thrasher Foundation, zatytułowanej „Regeneracja krwinek czerwonych i przeżycie po transfuzji u niemowląt”; oraz 2) NIH PPG Grant P01 HL046925, Projekt 1 zatytułowany „Przeżycie krwinek czerwonych po transfuzji u niemowląt”. Abstrakty dla obu znajdują się poniżej. Projekt ten zostanie zrealizowany w dwóch etapach:

Faza I obejmuje badania autologicznych biotynylowanych erytrocytów przetaczanych zdrowym dorosłym ochotnikom (patrz Cel szczegółowy nr 1 w Thrasher Foundation Abstract poniżej); I

Faza II obejmuje badania niemowląt wymagających transfuzji krwinek czerwonych zleconych przez lekarza (patrz Cele szczegółowe #2, #3 i #4 w Thrasher Foundation Abstract poniżej; oraz patrz Cel szczegółowy #4 w NIH, który jest w całości zawarty w trzech Thrasher przyznaj konkretne cele).

Studia Fazy I zostały zakończone i nie prowadzimy już naboru osób dorosłych. Trwają zapisy niemowląt na studia II fazy. Dodajemy te fazy sekwencyjnie na podstawie rekomendacji Marthy Jones w czasie, gdy nasza propozycja została po raz pierwszy złożona do IRB. Zastosowaliśmy wiedzę, którą zdobyliśmy w badaniach fazy I na dorosłych ochotnikach, aby wprowadzić modyfikacje naszego projektu badania dla fazy II, która ma być przeprowadzona u niemowląt, które otrzymały klinicznie zlecone transfuzje krwinek czerwonych. Na końcu Fazy II zawarto uzasadnienie włączenia nowej, porównawczej, „złotego standardu” metody określania przeżywalności czerwonych krwinek u niemowląt („aglutynacja różnicowa, metoda antygenowa”). Zakończyliśmy zapisy wszystkich osób dorosłych na I fazę.

STRESZCZENIE I (DO DOTACJI FUNDACJI THRASHER)

Tło:

Anemiczne, krytycznie chore noworodki należą do najczęściej poddawanych transfuzji grup pacjentów w USA. Szacuje się, że rocznie około 1 000 000 transfuzji krwinek czerwonych otrzymuje około 130 000 niemowląt. W przeciwieństwie do dorosłych brakuje ważnych danych dotyczących produktów transfuzyjnych dla optymalnego przeżycia czerwonych krwinek u niemowląt. Przyczyną tego braku są dwie główne zmiany wprowadzone niedawno w praktykach związanych z bankowaniem i transfuzją krwi noworodków. Są to: 1) użycie przetoczonej krwi dorosłego dawcy przechowywanej do 42 dni zgodnie z limitem FDA zamiast tylko używania krwi przechowywanej krócej niż 7 dni, jak to miało miejsce wcześniej; oraz 2) potencjalne wykorzystanie własnej krwi niemowlęcia pobranej z łożyska w celu uniknięcia ryzyka infekcji wirusowych i reakcji immunologicznych po transfuzji krwi dawcy. Niestety, nie ma ostatecznych badań niemowląt, które odnosiłyby się do tych zmian poprzez bezpośredni pomiar przeżywalności RBC. Takie badania niemowląt były utrudnione przez problemy techniczne. W szczególności dane dotyczące przeżywalności krwinek czerwonych muszą być dostosowane do wzrostu, utraty krwi w laboratorium i interweniujących dodatkowych transfuzji krwinek czerwonych, ale w praktyce tak nie jest. Co więcej, kwestie bezpieczeństwa wykluczyły wiele badań nad przeżywalnością noworodków (np. narażenie na radioaktywność 51Cr i usunięcie zbyt dużej ilości krwi z dzisiejszych maleńkich, wcześniaków). Rzeczywiście, przed rokiem 1970 (koniec stosowania 51Cr jako oznaczenia RBC w badaniach przeżywalności noworodków w krwinkach czerwonych) niemowlęta ważące przy urodzeniu mniej niż 1500 g często nie przeżywały, a dane dotyczące przeżywalności czerwonych krwinek nie istnieją dla dzisiejszych najmniejszych, najczęściej poddawanych transfuzji niemowląt których masa urodzeniowa wynosi 500-1000 g.

Cele szczegółowe:

Cel szczegółowy nr 1: Opracowanie in vitro i walidacja in vivo u dorosłych zdolności do biotynylacji erytrocytów przy maksymalnie 5 odrębnych gęstościach, które można zmierzyć za pomocą cytometrii przepływowej. Te pięć oznaczeń gęstości biotyny RBC zostanie wykorzystanych w Celach Szczegółowych nr 2, 3 i 4, aby jednocześnie określić przeżywalność RBC wielu odrębnych populacji przetoczonych krwinek czerwonych u wcześniaków.

Konkretny cel nr 2. Aby określić, czy przeżywalność krwinek czerwonych dawcy i krwinek czerwonych w łożysku jest znacznie dłuższa po skorygowaniu za pomocą modelowania matematycznego. Przewidujemy, że niemodelowane wartości znacznie zaniżają przeżycie RBC.

Konkretny cel nr 3. Porównanie długoterminowych wyników przeżycia krwinek czerwonych dla przetoczonych dorosłych dawców i krwinek czerwonych płodu/łożyska u noworodków z niedokrwistością. Przewidujemy, że szybszy wzrost płodów spowoduje większą erytropoezę stresową prowadzącą do wewnętrznych „defektów” RBC i skrócenia przeżycia RBC w porównaniu z RBC dorosłych dawców.

Konkretny cel nr 4. Aby określić ilościowo wpływ przechowywania na przeżycie RBC skorygowane modelem erytrocytów dorosłych dawców przetoczonych noworodkom. Przewidujemy, że przechowywanie krwinek czerwonych dawcy nie wpłynie na przeżywalność RBC.

Projekt badania:

Proponowane tutaj badania opierają się na metodach biotynylacji i modelowania matematycznego, które nasza grupa badawcza opracowała w celu dokładnego pomiaru przeżywalności RBC bez narażania niemowlęcia na radioaktywność. Metoda znakowania krwinek czerwonych biotyną jest dobrze dostosowana do noworodków, ponieważ umożliwia jednoczesne śledzenie wielu populacji krwinek czerwonych na <10 µl krwi. Przeżywalność erytrocytów znakowanych przy różnych gęstościach biotyny będzie określana ilościowo przy użyciu standardowych parametrów przeżycia erytrocytów, tj. krótkoterminowej regeneracji erytrocytów po transfuzji w ciągu 24 godzin i długoterminowej modelowanej przeżywalności erytrocytów, tj. do 50 i 100% erytrocytów znakowanych biotyną zniknęły z obiegu. Te dwa ostatnie pomiary zostaną obliczone przy użyciu wymaganych korekt matematycznych dotyczących wzrostu, utraty krwi w laboratorium i pośrednich transfuzji krwinek czerwonych.

Tylko konkretny cel nr 4 w abstrakcie Fundacji Thrashera obejmuje ludzkie niemowlęta. Cel szczegółowy nr 4) WYKORZYSTAĆ METODOLOGIE BIOTYNYLACJI RBC I MODELOWANIA MATEMATYCZNEGO ZATWIERDZONE U DOROSŁYCH OWC I NOWORODKÓW JAGNIĘT DO DOKŁADNEGO POMIARU KINETYKI RBC PO TRANSFUZJI U NOWORODKÓW Z ANEMIĄ, KTÓRYM PRZETOCZONO ŚWIEŻE AUTOLOGICZNE, ŚWIEŻE ALLOGENICZNE I PRZECHOWYWANE ALLOGENOWE RBC. Zastosowanie biotyny, nietoksycznej, nieradioaktywnej witaminy B, do jednoczesnego rozróżniania różnych populacji krwinek czerwonych za pomocą cytometrii przepływowej ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia naszych celów i ma wyraźną przewagę nad innymi metodami znakowania krwinek czerwonych, zarówno pod względem bezpieczeństwa, jak i dokładności. Wykorzystując cztery Cele szczegółowe, aby osiągnąć nasz cel, jakim jest ustanowienie bardziej skutecznych praktyk transfuzji poprzez określenie optymalnego produktu do transfuzji krwinek czerwonych do stosowania u NIEMOWLĄT z niedokrwistością.