Vliv membrány mléčných tukových globulí (MFGM) na ochranu střevní bariéry u běžců

Randomizovaná, dvojitě zaslepená zkřížená cvičební studie byla provedena se 14 běžci v kampusu Utah State University. Tato populace 14 běžců byla vybrána z větší populace 20, která byla vybrána k dokončení dvou počátečních zkoušek. Při dvou předběžných návštěvách byly stanoveny parametry nezbytné pro provedení experimentálního pokusu. Během první návštěvy byla stanovena výchozí hodnota pro propustnost střev a aerobní kapacitu běžců. Při druhé návštěvě byla testována schopnost dokončit běh při 80% VO2max a byl měřen vliv zátěže při cvičení na propustnost střeva, plazmatický LPS a teplotu jádra.

Jakmile byla vybrána testovací populace, byla provedena randomizovaná, dvojitě zaslepená, zkřížená studie, ve které byla MFGM testována na schopnost zabránit změně propustnosti střeva vyvolané cvičením.

Během každého testovacího sezení byla monitorována srdeční frekvence (HR), pracovní výkon a teplota jádra (CT). HR a CT byly monitorovány pomocí pilulky na teplotu CorTemp™, kterou sportovci požili před zkouškou (http://www.hqinc.net/pages/pill_page.html). Kromě toho byla krev odebrána na začátku (před zkouškou vyčerpání), bezprostředně po časové zkoušce a znovu v 1 h a 5 h. Krev byla analyzována na indexy intenzity tréninku (laktát), svalového poškození (kreatinkináza, cytokiny) a dysfunkce střevní bariéry (lipopolysacharid, cytokiny). Kromě toho hned po běhu sportovci konzumovali nápoj se dvěma sacharidy (laktulóza a rhamnóza). Během následujících šesti hodin byla shromažďována moč a tyto cukry byly měřeny plynovou chromatografií, aby se stanovila permeabilita střeva.

Subject Recruitment Dvacet běžců (ve věku 18-50 let) bylo zpočátku rekrutováno prostřednictvím školních letáků, inzerátů v místních novinách a týdenního sportovního průvodce. Účastníci, kteří měli anamnézu včetně: srdečních onemocnění, nekontrolované hypertenze, cukrovky, Crohnovy choroby, syndromu dráždivého tračníku, kolitidy, celiakie, zánětlivých nebo autoimunitních onemocnění nebo intolerance laktózy, byli ze studie vyloučeni. Všichni jedinci byli instruováni, aby se vyvarovali všech protizánětlivých léků po dobu alespoň 24 hodin před jakoukoli testovací aktivitou. Ráno v den první návštěvy bylo schváleným subjektům změřeno složení těla přístrojem BodPod (Life Measurement, Inc., Concord, CA). Účastníci byli požádáni, aby se zdrželi jakéhokoli těžkého cvičení po dobu 48 hodin před první návštěvou. Subjektům byla podána zkumavka o objemu 50 ml obsahující 5 g laktulózy a 2 g rhamnózové cukerné sondy a instruováni, aby sondu vypili 4 hodiny poté, co dokončili snídani, aby se určila základní hodnota propustnosti střeva. Subjektům byla dána nádoba na sběr moči a instruováni, aby shromažďovali veškerou moč po dobu 6 hodin po požití sondy. Subjekty neměly jíst oběd dříve než 1,5 hodiny po vypití cukrové sondy. Po 6 hodinách sběru moči se subjekty vrátily na místo testu a provedly běžící test VO2 max.

Druhá návštěva (přibližně jeden týden po první návštěvě) Přibližně 3 hodiny po dokončení snídaně se subjekty nahlásily na místo testu, aby jim byla odebrána krev (pro stanovení výchozí hodnoty LPS v plazmě), změřena hmotnost a spolknuta teplotní sonda. Účastníci zahájili cvičební výzvu (60minutový běh při 80% VO2 max) přibližně 4 hodiny po dokončení snídaně. Cvičení bylo provedeno v místnosti s řízenou klimatizací při 22 °C bez ventilátoru. Subjekty byly monitorovány, aby se zajistilo, že běží na 80 % VO2 max a nesmějí konzumovat vodu během expozice. Bezprostředně po cvičební výzvě účastníci zkonzumovali cukrové sondy. Změřila se hmotnost, odebrala se krev (plazma LPS po cvičení) a subjekty byly instruovány, aby sbíraly moč po dobu dalších šesti hodin. Aby se usnadnila rehydratace a produkce moči, subjekty byly instruovány, aby nahradily 150 % svých ztrát tekutin (hmotnost před cvičením a po cvičení) příjmem vody.

Po screeningu 20 subjektů souhlasila populace 15 subjektů s účastí ve zkřížené studii. Jeden subjekt vypadl z důvodu těhotenství a čtyři subjekty se mohly zúčastnit kvůli konfliktům v rozvrhu. Jeden subjekt odstoupil poté, co si utrpěl zlomeninu kotníku, která nesouvisela se studií.

Třetí a čtvrtá návštěva byla zkřížená část experimentu srovnávající MFGM s vehikulem. 3. a 4. návštěva byla totožná s 2. návštěvou s výjimkou toho, že účastníci vypili buď vehikulum pro náhradu tekutin nebo náhradu tekutin + MFGM 1 hodinu před cvičební výzvou a znovu bezprostředně po cvičení. Účastníci a personál provádějící experimentální protokoly byli zaslepeni k léčbě pomocí kódovaných, neprůhledných nádob na nápoje. Subjekty dokončí 4. návštěvu o týden později a konzumují nápoj vehikula nebo vehikulum + MFGM.

Pro zkříženou část studie dostali sportovci jeden ze dvou nápojů. Kontrolní nápoj byl formulován podle aktuálních pokynů pro sportovní výživu pro dodávání živin před i po tréninku. Obsahoval syrovátkový protein, sacharózu, maltodextriny, čokoládové aroma a malé množství máslového oleje. Testovaný nápoj byl identický z hlediska obsahu makroživin, ale obsahoval přísadu na bázi mléka nazývanou „membrána mléčných kuliček“. Tento materiál je izolován z vedlejšího produktu výroby másla a je bohatý na fosfolipidy. Nápoje byly podávány tři hodiny před cvičební zkouškou a také bezprostředně po ní. Testovaný nápoj obsahoval prášek bohatý na MFGM, který vyrábí Arla Foods (Lacprodan PL-20), který obsahuje zhruba 20 % fosfolipidů a 60 % bílkovin. Ve studiích na myších zaznamenali Dial et al účinky na ochranu střev za 1 hodinu, pokud jsou zvířatům poskytnuty fosfolipidy v dávce 100 mg/kg tělesné hmotnosti. Druhý nápoj byl přizpůsoben obsahu makroživin, ale neobsahoval fosfolipidový prášek.

Měřené koncové body Změna propustnosti střeva Ke stanovení klidové, základní střevní propustnosti byla použita metoda Pals. Tato metoda určuje střevní propustnost dodáním nestravitelných cukrů laktulózy a rhamnózy a odhaduje střevní a žaludeční permeabilitu získáním těchto cukerných sond v moči. Ve zdravém střevním epitelu má laktulóza velmi omezený transport přes střevní bariéru. Rhamnóza prochází přes epitel tenkého střeva transcelulární cestou a slouží jako vnitřní kontrola, která zohledňuje rychlost vyprazdňování žaludku, dobu průchodu střevem a funkci ledvin. Větší molekula laktulózy může procházet střevním epitelem pouze paracelulární cestou přes těsné spoje. Proto vyšší poměr laktulózy k rhamnóze zachycené v moči ukazuje na narušenou funkci střevní bariéry. Bylo prokázáno, že zátěžový stres významně zvyšuje poměr laktulóza/rhamnóza v moči. Podobně jako u našeho navrhovaného modelu zátěžového cvičení byla tato metoda použita k prokázání toho, že běh na 80 % VO2max po dobu jedné hodiny zdvojnásobuje propustnost střev ve srovnání s výchozí hodnotou.

Změna plazmatického LPS: Pro hodnocení endotoxémie byly plazmatické koncentrace LPS měřeny prostřednictvím kinetické aktivity, jak je popsáno Niemanem. Plazmatický LPS byl měřen z krve odebrané před cvičením (základní hodnota), bezprostředně po cvičení a 1 a 5 hodin po cvičení. Bylo prokázáno, že plazmatický LPS se zvyšuje po vytrvalostních cvičeních a předpokládá se, že je výsledkem aberantní bakteriální translokace střevních bakterií přes narušenou střevní bariéru. Zvýšená hladina LPS v plazmě od výchozí hodnoty ihned po cvičení byla prokázána již dříve po půlmaratonu, plném maratonu. Předpokládalo se, že plazmatické hladiny LPS se po zátěžovém stresu zvýší a budou korelovat s tělesnou teplotou a indexem laktulóza/rhamnóza integrity střevní bariéry.

Změna zánětlivých cytokinů: Plazmatické hladiny IL-6, TNFα, IL-10, IL-17, INFγ, IL-3, MCP-1, IL-15 a GMCSF byly měřeny ve výchozím stavu a ve vzorcích 1 h po cvičení . Koncentrace cytokinů byly stanoveny multiplexním enzymem-linked immunosorbent assay (ELISA) od komerčního dodavatele (Quansys Biosystems, Logan, UT). Tyto cytokiny byly vybrány na základě předchozí studie zkoumající prosakování střev a spotřebu MFGM ve studii propustnosti střev stimulované LPS na myších. Všechny cytokiny byly významně upregulovány u zvířat s netěsnými střevy kromě GMCSF a byly významně sníženy u zvířat krmených MFGM ve srovnání s kontrolami. Kromě toho Ng et al prokázali zvýšené plazmatické hladiny IL-10 a IL-6 (50% a 65,2% nárůst oproti výchozí hodnotě) u běžců bezprostředně po půlmaratonu. Podobně bylo prokázáno, že plazmatické hladiny IL-6 a TNFa jsou zvýšeny od výchozí hodnoty bezprostředně po maratonu. Na základě předběžných údajů a výše uvedených studií se očekávalo, že po zátěžové zátěži budou naměřeny zvýšené hladiny zánětlivých cytokinů a předpokládalo se, že MFGM tento efekt zruší ve srovnání s jinými regeneračními nápoji.

Změna plazmatické kreatinkinázy: Kreatinkináza byla měřena ve vzorcích odebraných před, bezprostředně po a 1 hodinu po zátěžové zátěži. Kreatinkináza byla měřena pomocí komerční kolorimetrické soupravy (Sigma) v 96-jamkové UV/vis čtečce destiček (Molecular Devices). Zvýšená plazmatická kreatinkináza je dobře zavedený index poškození svalů vyvolaného cvičením. V podobné studii měli cyklisté jedoucí na 85 % VO2 max až do vyčerpání po vyčerpání glykogenu předchozího dne méně plazmatické kreatinkinázy, když konzumovali čokoládové mléko jako regenerační nápoj ve srovnání s nápojem nahrazujícím sacharidy.

Plazmatický laktát: Pro posouzení anaerobního metabolismu bude plazmatický laktát změřen na začátku, bezprostředně po zátěži a 2 hodiny po ní. Laktát bude měřen pomocí enzymatického testovacího kitu (r-Biopharm, Marshall, MI).

Primárním cílovým parametrem měřeným v této studii byly poměry laktulóza/rhamnóza v moči a LPS v plazmě. Data byla analyzována jednofaktorovou ANOVA a významné rozdíly byly zkoumány post-hoc testováním. Tělesná teplota byla měřena v reálném čase a korelovala s hypoxií střeva a prosakováním střev.

Všechny složky měřené v krvi (laktát, LPS, cytokiny a CK) byly analyzovány dvoufaktorovou ANOVA s časem a léčbou jako proměnnými. Laktát byl zahrnut, protože je obecně považován za index anaerobní aktivity. Dalším parametrem, který nás zajímal, je kreatinkináza. Jak již bylo zmíněno v úvodu, tento enzym je detekován v krvi po intenzivním cvičení a předpokládá se, že koreluje s poškozením svalů. Kromě toho nejméně dvě studie s čokoládovým mlékem zaznamenaly, že plazmatická hladina CK je nižší u sportovců pijících čokoládové mléko v porovnání s jinými regeneračními nápoji.

Plán řízení Všichni tři výzkumní pracovníci se aktivně zapojili do plánování a provádění této studie, jakož i do zpracování vzorků a analýzy. Dr. Ward byl zodpovědný za formulaci nápoje MFGM. Kromě toho byl Dr. Ward zodpovědný za GC-FID analýzu moči. Kromě toho bude Dr. Ward dohlížet na postgraduálního studenta podporovaného tímto projektem.

Dr. Bressel naverboval sportovce a pomohl s organizací testů. Dr. Bressel navíc dohlížel na všechny výkonnostní zkoušky a sběr dat o cvičení.

Dr. Hintze měl na starosti vzorky krve a moči. Student (a možná i Dr. Hintze) provedl LPS testy na laktát a CK. Kromě toho byl Dr. Hintze zodpovědný za správné předávání vzorků krve a za dodání vzorku společnosti Quansys Biosystems pro analýzu cytokinů.

Všichni tři PI spolupracovali na analýze dat a přípravě rukopisu.