Влияние мембран молочных жировых глобул (MFGM) на защиту кишечного барьера у бегунов

Было проведено рандомизированное двойное слепое перекрестное исследование упражнений с участием 14 бегунов в кампусе Университета штата Юта. Эта группа из 14 бегунов была выбрана из более крупной группы из 20 человек, которые были набраны для завершения двух первоначальных испытаний. В два предварительных визита были определены параметры, необходимые для проведения экспериментального исследования. Во время первого визита у бегунов определяли исходное значение проницаемости кишечника, а также аэробных возможностей. Во время второго визита тестировали способность выполнять пробежку при 80% VO2max и измеряли влияние физической нагрузки на проницаемость кишечника, LPS плазмы и температуру тела.

После того, как тестовая популяция была выбрана, было проведено рандомизированное двойное слепое перекрестное исследование, в котором MFGM проверяли на способность предотвращать изменение проницаемости кишечника, вызванное физической нагрузкой.

Во время каждого сеанса тестирования контролировали частоту сердечных сокращений (ЧСС), работоспособность и температуру тела (КТ). ЧСС и КТ контролировались с помощью температурной таблетки CorTemp™, которую спортсмены принимали перед испытанием (http://www.hqinc.net/pages/pill_page.html). Кроме того, кровь брали на исходном уровне (до испытания на истощение), сразу после испытания на время и снова через 1 и 5 часов. Кровь анализировали на показатели интенсивности тренировок (лактат), повреждения мышц (креатинкиназа, цитокины) и дисфункцию кишечного барьера (липополисахариды, цитокины). Кроме того, сразу после бега спортсмены употребляли напиток с двумя углеводами (лактулозой и рамнозой). В течение следующих шести часов собирали мочу и измеряли эти сахара с помощью газовой хроматографии для определения проницаемости кишечника.

Набор испытуемых Двадцать бегунов (в возрасте от 18 до 50 лет) первоначально были набраны с помощью листовок кампуса, объявлений в местной газете и еженедельного спортивного справочника. Участники, у которых в анамнезе были болезни сердца, неконтролируемая гипертония, диабет, болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, колит, глютеновая болезнь, воспалительные или аутоиммунные заболевания или непереносимость лактозы, были исключены из исследования. Все испытуемые были проинструктированы избегать приема всех противовоспалительных препаратов по крайней мере за 24 часа до любого тестирования. Утром в день первого визита у утвержденных испытуемых измеряли состав тела с помощью BodPod (Life Measurement, Inc., Concord, CA). Участников попросили воздержаться от любых тяжелых упражнений в течение 48 часов до первого визита. Субъектам давали пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 г лактулозы и 2 г рамнозы, и давали указание выпить пробу через 4 часа после того, как они закончили завтракать, чтобы определить исходную проницаемость кишечника. Субъектам давали контейнер для сбора мочи и инструктировали собирать всю мочу в течение 6 часов после проглатывания зонда. Субъекты не должны были есть обед в течение 1,5 часов после употребления сахарного зонда. После 6 часов сбора мочи испытуемые возвращались на место проведения испытаний и выполняли беговой тест VO2 max.

Второй визит (примерно через неделю после первого визита) Примерно через 3 часа после завершения завтрака субъекты сообщали в испытательный центр, что у них брали кровь (для определения исходного уровня LPS в плазме), измеряли вес и принимали датчик температуры. Участники приступили к выполнению упражнений (60-минутный бег при 80% VO2 max) примерно через 4 часа после завершения завтрака. Упражнения проводились в комнате с климат-контролем при температуре 22 ° C без вентилятора. Субъекты находились под наблюдением, чтобы убедиться, что они работают с 80% VO2 max, и им не разрешалось потреблять воду во время испытания. Сразу после тренировки участники потребляли сахарные зонды. Измеряли вес, брали кровь (после тренировки ЛПС плазмы) и испытуемым давали указание собирать мочу в течение следующих шести часов. Чтобы облегчить регидратацию и выработку мочи, испытуемых проинструктировали возмещать 150% потерь жидкости (до и после физической нагрузки) потреблением воды.

После скрининга 20 субъектов группа из пятнадцати субъектов согласилась принять участие в перекрестном испытании. Один субъект выбыл из-за беременности, а четыре субъекта могли участвовать из-за конфликтов в расписании. Один субъект выбыл из исследования после перелома лодыжки, не связанного с исследованием.

Третий и четвертый визиты были перекрестной частью эксперимента по сравнению MFGM с транспортным средством. 3-й и 4-й визиты были идентичны 2-му визиту, за исключением того, что участники выпивали либо носитель для замены жидкости, либо замену жидкости + MFGM за 1 час до физической нагрузки и снова сразу после тренировки. Участники и персонал, проводивший экспериментальные протоколы, не знали о методах лечения с помощью закодированных непрозрачных контейнеров для напитков. Субъекты завершают 4-й визит через неделю и употребляют напиток, содержащий носитель, или носитель + MFGM.

Для перекрестной части исследования спортсменам давали один из двух напитков. Контрольный напиток был приготовлен в соответствии с действующими рекомендациями по спортивному питанию для доставки питательных веществ как до, так и после тренировки. Он содержал сывороточный протеин, сахарозу, мальтодекстрины, шоколадный ароматизатор и небольшое количество сливочного масла. Тестируемый напиток был идентичен по содержанию макронутриентов, но содержал ингредиент на основе молока, называемый «мембраной шариков молочного жира». Этот материал выделяют из побочного продукта производства масла и богат фосфолипидами. Напитки давали за три часа до пробной тренировки, а также сразу после нее. Тестируемый напиток содержал порошок с высоким содержанием MFGM, производимый Arla Foods (Lacprodan PL-20), который содержит примерно 20% фосфолипидов и 60% белка. В исследованиях на мышах Dial et al. отметили влияние на защиту кишечника через 1 час, когда животным давали фосфолипиды в дозе 100 мг/кг массы тела. Второй напиток соответствовал содержанию макронутриентов, но не содержал фосфолипидного порошка.

Измеряемые конечные точки Изменение проницаемости кишечника. Для определения исходной проницаемости кишечника в покое использовали метод Палса. Этот метод определяет кишечную проницаемость путем введения неперевариваемых сахаров лактулозы и рамнозы, а также оценивает кишечную и желудочную проницаемость путем обнаружения этих сахарных зондов в моче. В здоровом кишечном эпителии лактулоза имеет очень ограниченный транспорт через кишечный барьер. Рамноза проникает через эпителий тонкой кишки трансцеллюлярным путем и служит в качестве внутреннего контроля для учета скорости опорожнения желудка, времени кишечного транзита и функции почек. Более крупная молекула лактулозы может пересекать эпителий кишечника только парацеллюлярным путем через плотные контакты. Следовательно, более высокое соотношение лактулозы и рамнозы, выделенной с мочой, указывает на нарушение барьерной функции кишечника. Было показано, что физическая нагрузка значительно увеличивает соотношение лактулоза/рамноза в моче. Подобно предложенной нами модели физической нагрузки, этот метод был использован для демонстрации того, что бег при 80% VO2max в течение часа удваивает проницаемость кишечника по сравнению с исходным уровнем.

Изменение уровня ЛПС в плазме. Для оценки эндотоксемии концентрации ЛПС в плазме измеряли с помощью кинетической активности, как описано Ниманом. Уровень LPS в плазме измеряли в крови, взятой до тренировки (базовый уровень), сразу после нее, а также через 1 и 5 часов после тренировки. Было продемонстрировано, что LPS в плазме увеличивается после упражнений на выносливость, и предполагается, что это результат аберрантной бактериальной транслокации кишечных бактерий через нарушенный кишечный барьер. Повышенный уровень LPS в плазме по сравнению с исходным уровнем сразу после тренировки был продемонстрирован ранее после полумарафона, полного марафона. Ожидалось, что уровни ЛПС в плазме будут увеличиваться после физической нагрузки и будут коррелировать с внутренней температурой тела и лактулозно-рамнозным индексом целостности кишечного барьера.

Изменение воспалительных цитокинов: уровни IL-6, TNFα, IL-10, IL-17, INFγ, IL-3, MCP-1, IL-15 и GMCSF в плазме измерялись в исходном состоянии и в образцах через 1 час после тренировки. . Концентрации цитокинов определяли с помощью мультиплексного твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) коммерческим поставщиком (Quansys Biosystems, Logan, UT). Эти цитокины были выбраны на основе предыдущего исследования, изучающего негерметичность кишечника и потребление MFGM в испытании на негерметичность кишечника, стимулированном LPS, на мышах. Все цитокины были значительно повышены у животных с негерметичным кишечником, за исключением GMCSF, и значительно снижены у животных, получавших MFGM, по сравнению с контрольной группой. Кроме того, Ng и др. продемонстрировали повышенные уровни IL-10 и IL-6 в плазме (увеличение на 50% и 65,2% по сравнению с исходным уровнем соответственно) у бегунов сразу после полумарафона. Точно так же было продемонстрировано, что уровни IL-6 и TNFα в плазме повышаются по сравнению с исходным уровнем сразу после марафона. Основываясь на предварительных данных и вышеупомянутых исследованиях, предполагалось, что повышенные уровни воспалительных цитокинов будут измеряться после физической нагрузки, и предполагалось, что MFGM аннулирует этот эффект по сравнению с другими восстановительными напитками.

Изменение уровня креатинкиназы в плазме: Креатинкиназу измеряли в образцах, взятых до, сразу после и через 1 час после физической нагрузки. Креатинкиназу измеряли с использованием коммерческого колориметрического набора (Sigma) в 96-луночном планшет-ридере UV/Vis (Molecular Devices). Повышение уровня креатинкиназы в плазме является общепризнанным показателем повреждения мышц, вызванного физической нагрузкой. В аналогичном исследовании у велосипедистов, ехавших с 85% VO2 max до истощения после истощения гликогена накануне, было меньше креатинкиназы в плазме, когда они употребляли шоколадное молоко в качестве восстанавливающего напитка по сравнению с напитком, заменяющим углеводы.

Лактат плазмы: для оценки анаэробного метаболизма уровень лактата плазмы измеряют исходно, сразу после и через 2 часа после физической нагрузки. Лактат будет измеряться с использованием набора для ферментативного тестирования (r-Biopharm, Marshall, MI).

Первичной конечной точкой, измеренной в этом исследовании, было соотношение лактулоза/рамноза в моче и ЛПС плазмы. Данные были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, и существенные различия были изучены с помощью апостериорного тестирования. Центральную температуру тела измеряли в режиме реального времени и коррелировали с гипоксией кишечника и негерметичностью кишечника.

Все компоненты, измеренные в крови (лактат, ЛПС, цитокины и КФК), анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа со временем и лечением в качестве переменных. Лактат был включен, поскольку он обычно считается показателем анаэробной активности. Еще один интересующий нас параметр — креатинкиназа. Как упоминалось во введении, этот фермент обнаруживается в крови после интенсивных упражнений и, как считается, коррелирует с повреждением мышц. Кроме того, как минимум два исследования шоколадного молока показали, что у спортсменов, пьющих шоколадное молоко, КК в плазме ниже, чем у других восстановительных напитков.

План управления Все три ИП принимали активное участие в планировании и проведении этого исследования, а также в обработке и анализе проб. Доктор Уорд отвечал за рецептуру напитка MFGM. Кроме того, д-р Уорд отвечал за анализ мочи методом ГХ-ПИД. Кроме того, доктор Уорд будет руководить аспирантом, которого поддерживает этот проект.

Доктор Брессель набирал спортсменов и помогал с организацией тестов. Кроме того, д-р Брессель руководил всеми испытаниями работоспособности и сбором данных об упражнениях.

Доктор Хинтце отвечал за образцы крови и мочи. Студент (и, возможно, доктор Хинтце) проводил анализы LPS, лактата и CK. Кроме того, д-р Хинтце отвечал за надлежащее обращение с образцами крови и доставку образцов в компанию Quansys Biosystems для анализа цитокинов.

Все три PI сотрудничали в анализе данных и подготовке рукописи.