Efeito da Membrana de Glóbulos de Gordura do Leite (MFGM) na Proteção da Barreira Intestinal em Corredores

Um estudo randomizado, duplo-cego de exercícios cruzados foi realizado com 14 corredores no campus da Universidade Estadual de Utah. Esta população de 14 corredores foi selecionada de uma população maior de 20 que foi recrutada para completar duas tentativas iniciais. Em duas visitas preliminares, foram determinados os parâmetros necessários para a condução do ensaio experimental. Durante a primeira visita, um valor basal foi determinado para a permeabilidade intestinal, bem como para a capacidade aeróbica dos corredores. Na segunda visita, a capacidade de completar uma corrida a 80% do VO2max foi testada e o efeito do estresse do exercício na permeabilidade intestinal, LPS plasmático e temperatura central foram medidos.

Uma vez que uma população de teste foi selecionada, um estudo randomizado, duplo-cego e cruzado foi conduzido no qual o MFGM foi testado quanto à capacidade de prevenir uma mudança na permeabilidade intestinal induzida pelo exercício.

Durante cada sessão de teste, a frequência cardíaca (FC), a produção de trabalho e a temperatura central (TC) foram monitoradas. A FC e a TC foram monitoradas por uma pílula de temperatura CorTemp™ que foi ingerida pelos atletas antes do teste (http://www.hqinc.net/pages/pill_page.html). Além disso, o sangue foi coletado na linha de base (antes do teste de depleção), imediatamente após o teste de tempo e novamente em 1h e 5h. O sangue foi analisado quanto aos índices de intensidade de treinamento (lactato), dano muscular (creatina quinase, citocinas) e disfunção da barreira intestinal (lipopolissacarídeo, citocinas). Além disso, imediatamente após a corrida, os atletas consumiram uma bebida com dois carboidratos (lactulose e ramnose). Durante as seis horas seguintes, a urina foi coletada e esses açúcares foram medidos por meio de cromatografia gasosa para determinar a permeabilidade do intestino.

Recrutamento de participantes Vinte corredores (de 18 a 50 anos) foram inicialmente recrutados por meio de folhetos do campus, anúncios no jornal local e guias esportivos semanais. Os participantes que tinham históricos médicos, incluindo: doença cardíaca, hipertensão não controlada, diabetes, doença de Crohn, síndrome do intestino irritável, colite, doença celíaca, doenças inflamatórias ou autoimunes ou intolerância à lactose foram excluídos do estudo. Todos os indivíduos foram instruídos a evitar todos os medicamentos anti-inflamatórios por pelo menos 24 horas antes de qualquer atividade de teste. Na manhã da primeira visita, os indivíduos aprovados tiveram a composição corporal medida pelo BodPod (Life Measurement, Inc., Concord, CA). Os participantes foram convidados a abster-se de qualquer exercício pesado por 48 horas antes da primeira visita. Os indivíduos receberam um tubo de 50 ml contendo 5 g de lactulose e 2 g de açúcar ramnose e foram instruídos a beber a sonda 4 horas após terem terminado o café da manhã para determinar a permeabilidade intestinal basal. Os indivíduos receberam um recipiente de coleta de urina e foram instruídos a coletar toda a urina por 6 horas após a ingestão da sonda. Os indivíduos não deveriam almoçar até 1,5 horas depois de beber a sonda de açúcar. Após 6 horas de coleta de urina, os indivíduos retornaram ao local do teste e realizaram um teste de VO2 máx.

Segunda visita (aproximadamente uma semana após a primeira visita) Aproximadamente 3 horas após a conclusão do café da manhã, os indivíduos relataram ao local do teste a coleta de sangue (para determinar o LPS plasmático basal), o peso medido e a ingestão de uma sonda de temperatura. Os participantes iniciaram o desafio do exercício (60 minutos de corrida a 80% VO2 máx.) aproximadamente 4 horas após o término do café da manhã. O desafio do exercício foi conduzido em uma sala climatizada a 22°C sem ventilador. Os indivíduos foram monitorados para garantir que estavam correndo a 80% do VO2 máximo e não podiam consumir água durante o desafio. Imediatamente após o desafio do exercício, os participantes consumiram as sondas de açúcar. O peso foi medido, o sangue coletado (LPS de plasma pós-exercício) e os indivíduos foram instruídos a coletar sua urina nas próximas seis horas. Para facilitar a rehidratação e a produção de urina, os indivíduos foram instruídos a repor 150% de suas perdas de líquidos (pré a pós-peso do exercício) pela ingestão de água.

Após a triagem de 20 indivíduos, uma população de quinze indivíduos concordou em participar do estudo cruzado. Um sujeito desistiu devido a gravidez e quatro sujeitos puderam participar devido a conflitos de agendamento. Um sujeito desistiu após sofrer uma fratura no tornozelo que não estava relacionada ao estudo.

A terceira e a quarta visitas foram a parte cruzada do experimento comparando o MFGM ao veículo. A 3ª e 4ª visitas foram idênticas à 2ª visita, exceto que os participantes beberam o veículo de reposição de fluidos ou reposição de fluidos + MFGM 1 hora antes do desafio do exercício e novamente imediatamente após o exercício. Os participantes e o pessoal que administrava os protocolos experimentais desconheciam os tratamentos pelo uso de recipientes de bebida codificados e não transparentes. Os sujeitos completam a 4ª visita uma semana depois e consomem a bebida do veículo ou o veículo + MFGM.

Para a parte cruzada do estudo, os atletas receberam uma das duas bebidas. A bebida de controle foi formulada de acordo com as diretrizes atuais de nutrição esportiva para o fornecimento de nutrientes pré e pós-treino. Continha whey protein, sacarose, maltodextrinas, aromatizante de chocolate e uma pequena quantidade de óleo de manteiga. A bebida de teste era idêntica em um teor de macronutrientes, mas continha um ingrediente à base de leite chamado 'membrana de glóbulo de gordura do leite'. Este material é isolado de um subproduto da produção de manteiga e é rico em fosfolipídios. As bebidas foram fornecidas três horas antes do exercício e imediatamente após. A bebida de teste continha um pó rico em MFGM produzido pela Arla Foods (Lacprodan PL-20) que contém aproximadamente 20% de fosfolipídios e 60% de proteína. Em estudos com camundongos, Dial et al observaram efeitos na proteção intestinal em 1 h quando os animais receberam fosfolipídios a 100mg/kg de peso corporal. A segunda bebida foi igualada pelo teor de macronutrientes, mas não continha o fosfolipídio em pó.

Pontos finais medidos Alteração na permeabilidade intestinal Para determinar a permeabilidade intestinal basal, o método de Pals foi usado. Este método determina a permeabilidade intestinal pelo fornecimento dos açúcares não digeríveis lactulose e ramnose e estima a permeabilidade intestinal e gástrica pela recuperação desses açúcares na urina. Em epitélios intestinais saudáveis, a lactulose tem transporte muito limitado através da barreira intestinal. A ramnose atravessa o epitélio do intestino delgado por via transcelular e serve como controle interno para contabilizar a taxa de esvaziamento gástrico, o tempo de trânsito intestinal e a função renal. A molécula maior de lactulose só pode atravessar o epitélio intestinal por meio de uma rota paracelular através de junções apertadas. Portanto, uma proporção mais alta de lactulose para ramnose recuperada na urina indica função de barreira intestinal comprometida. Foi demonstrado que o estresse do exercício aumenta significativamente a relação lactulose/ramnose urinária. Semelhante ao nosso modelo de estresse de exercício proposto, esse método foi usado para demonstrar que correr a 80% do VO2max por uma hora dobra a permeabilidade intestinal em comparação com a linha de base.

Alteração no LPS plasmático: Para avaliar a endotoxemia, as concentrações plasmáticas de LPS foram medidas por meio de uma atividade cinética conforme descrito por Nieman. O LPS plasmático foi medido a partir do sangue coletado antes do exercício (linha de base), imediatamente após e 1 e 5 horas após o teste de exercício. Demonstrou-se que o LPS plasmático aumenta após sessões de exercícios de resistência e acredita-se que seja o resultado da translocação bacteriana aberrante de bactérias intestinais através da barreira intestinal comprometida. O LPS plasmático elevado da linha de base imediatamente após o exercício foi demonstrado anteriormente após uma meia maratona, maratona completa. Previu-se que os níveis plasmáticos de LPS aumentariam após o estresse do exercício e estariam correlacionados com a temperatura corporal central e o índice lactulose/ramnose da integridade da barreira intestinal.

Alteração nas citocinas inflamatórias: os níveis plasmáticos de IL-6, TNFα, IL-10, IL-17, INFγ, IL-3, MCP-1, IL-15 e GMCSF foram medidos na linha de base e nas amostras de 1 h após o exercício . As concentrações de citocinas foram determinadas por ensaio de imunoabsorção enzimática multiplex (ELISA) por um fornecedor comercial (Quansys Biosystems, Logan, UT). Essas citocinas foram selecionadas com base em um estudo anterior que investigou o vazamento intestinal e o consumo de MFGM em um teste de vazamento intestinal estimulado por LPS com camundongos. Todas as citocinas foram significativamente aumentadas em animais com intestino permeável, exceto GMCSF, e foram significativamente reduzidas em animais alimentados com MFGM em comparação com os controles. Além disso, Ng et al demonstraram aumento dos níveis plasmáticos de IL-10 e IL-6 (aumento de 50% e 65,2% da linha de base, respectivamente) em corredores imediatamente após uma meia maratona. Da mesma forma, foi demonstrado que os níveis plasmáticos de IL-6 e TNFα aumentam desde a linha de base imediatamente após uma maratona. Com base nos dados preliminares e nos estudos mencionados acima, antecipou-se que os níveis aumentados de citocinas inflamatórias seriam medidos após o desafio do exercício e foi hipotetizado que o MFGM anularia esse efeito em comparação com outras bebidas de recuperação.

Alteração na creatina quinase plasmática: A creatina quinase foi medida em amostras coletadas antes, imediatamente após e 1 hora após o desafio do exercício. A creatina quinase foi medida usando um kit colorimétrico comercial (Sigma) em um leitor de placas UV/vis de 96 poços (Molecular Devices). O aumento da creatina quinase plasmática é um índice bem estabelecido de dano muscular induzido pelo exercício. Em um estudo semelhante, ciclistas pedalando a 85% do VO2 máximo até a exaustão após a depleção de glicogênio no dia anterior tiveram menos creatina quinase plasmática quando consumiram leite achocolatado como bebida de recuperação em comparação com uma bebida de reposição de carboidratos.

Lactato Plasmático: Para avaliar o metabolismo anaeróbio, o lactato plasmático será medido no início, imediatamente após e 2 horas após o estresse do exercício. O lactato será medido usando um kit de teste enzimático (r-Biopharm, Marshall, MI).

O endpoint primário medido neste estudo foi a relação lactulose/ramnose na urina e plasma LPS. Os dados foram analisados ​​por ANOVA de fator único e as diferenças significativas foram exploradas com testes post-hoc. A temperatura corporal central foi medida em tempo real e foi correlacionada com a hipóxia intestinal e com o vazamento intestinal.

Todos os componentes medidos no sangue (lactato, LPS, citocinas e CK) foram analisados ​​por uma ANOVA de dois fatores com tempo e tratamento como variáveis. O lactato foi incluído porque geralmente é considerado um índice de atividade anaeróbica. Um outro parâmetro em que estamos interessados ​​é a creatina quinase. Conforme mencionado na introdução, essa enzima é detectada no sangue após exercícios intensos e acredita-se que esteja correlacionada com danos aos músculos. Além disso, pelo menos dois estudos com leite achocolatado observaram que a CK plasmática é menor em atletas que bebem leite achocolatado em comparação com outras bebidas de recuperação.

Plano de manejo Todos os três PIs estiveram ativamente envolvidos no planejamento e execução deste estudo, bem como no processamento da amostra e na análise. Dr. Ward foi responsável pela formulação da bebida MFGM. Além disso, o Dr. Ward foi responsável pela análise GC-FID da urina. Além disso, o Dr. Ward supervisionará um aluno de pós-graduação apoiado por este projeto.

Dr. Bressel recrutou os atletas e ajudou na organização dos testes. Além disso, o Dr. Bressel supervisionou todas as tentativas de desempenho e a coleta dos dados do exercício.

O Dr. Hintze estava encarregado das amostras de sangue e urina. O aluno (e talvez o Dr. Hintze) conduziu os ensaios de LPS, lactato e CK. Além disso, o Dr. Hintze foi responsável pela entrega adequada da amostra de sangue e pela entrega da amostra à Quansys Biosystems para a análise de citocinas.

Todos os três PIs colaboraram na análise dos dados e na preparação do manuscrito.