Wpływ membrany kuleczek tłuszczu mlecznego (MFGM) na ochronę bariery jelitowej u biegaczy

Randomizowana, podwójnie ślepa próba ćwiczeń krzyżowych została przeprowadzona z udziałem 14 biegaczy na kampusie Utah State University. Ta populacja 14 biegaczy została wybrana z większej populacji 20 osób, które zostały zwerbowane do ukończenia dwóch wstępnych prób. W dwóch wizytach wstępnych określono parametry niezbędne do przeprowadzenia próby doświadczalnej. Podczas pierwszej wizyty określono wyjściową wartość przepuszczalności jelit oraz wydolności tlenowej biegaczy. Podczas drugiej wizyty zbadano zdolność do ukończenia biegu przy 80% VO2max i zmierzono wpływ wysiłku fizycznego na przepuszczalność jelit, LPS w osoczu i temperaturę głęboką.

Po wybraniu populacji testowej przeprowadzono randomizowaną, podwójnie ślepą próbę krzyżową, w której testowano MFGM pod kątem zdolności do zapobiegania zmianom w przepuszczalności jelit wywołanej wysiłkiem fizycznym.

Podczas każdej sesji testowej monitorowano tętno (HR), wydajność pracy i temperaturę wewnętrzną (CT). HR i CT monitorowano za pomocą pigułki na temperaturę CorTemp™, którą sportowcy przyjmowali przed badaniem (http://www.hqinc.net/pages/pill_page.html). Ponadto krew pobierano na linii podstawowej (przed próbą wyczerpania), bezpośrednio po próbie czasowej i ponownie po 1 godzinie i 5 godzinach. Krew analizowano pod kątem wskaźników intensywności treningu (mleczany), uszkodzeń mięśni (kinaza kreatynowa, cytokiny) i dysfunkcji bariery jelitowej (lipopolisacharydy, cytokiny). Dodatkowo bezpośrednio po biegu sportowcy spożywali napój z dwoma węglowodanami (laktuloza i ramnoza). W ciągu następnych sześciu godzin zbierano mocz i mierzono te cukry za pomocą chromatografii gazowej w celu określenia przepuszczalności jelita.

Temat Rekrutacja Dwudziestu biegaczy (w wieku 18-50 lat) początkowo rekrutowano za pośrednictwem ulotek kampusowych, ogłoszeń w lokalnej gazecie i cotygodniowego przewodnika sportowego. Z badania wykluczono osoby, u których w przeszłości występowały choroby serca, niekontrolowane nadciśnienie, cukrzyca, choroba Leśniowskiego-Crohna, zespół jelita drażliwego, zapalenie okrężnicy, celiakia, choroby zapalne lub autoimmunologiczne lub nietolerancja laktozy. Wszystkich pacjentów poinstruowano, aby unikali wszelkich leków przeciwzapalnych przez co najmniej 24 godziny przed jakąkolwiek czynnością testową. Rankiem w dniu pierwszej wizyty u zatwierdzonych osób zmierzono skład ciała za pomocą BodPod (Life Measurement, Inc., Concord, CA). Uczestników poproszono o powstrzymanie się od jakichkolwiek ciężkich ćwiczeń przez 48 godzin przed pierwszą wizytą. Badanym podano probówkę o pojemności 50 ml zawierającą próbkę 5 g laktulozy i 2 g cukru ramnozy i poinstruowano ją, aby wypiła sondę 4 godziny po zakończeniu śniadania, aby określić wyjściową przepuszczalność jelit. Osobnikom podano pojemnik do zbierania moczu i poinstruowano, aby zbierali cały mocz przez 6 godzin po spożyciu sondy. Badani nie mogli jeść obiadu do 1,5 godziny po wypiciu sondy cukrowej. Po 6 godzinach pobierania moczu badani wracali na miejsce badania i wykonywali biegowy test VO2 max.

Druga wizyta (w przybliżeniu jeden tydzień po pierwszej wizycie) Około 3 godziny po zakończeniu śniadania, badani zgłaszali się na miejsce badania w celu pobrania krwi (w celu określenia wyjściowego LPS w osoczu), zmierzenia masy ciała i spożycia sondy do pomiaru temperatury. Uczestnicy rozpoczęli wyzwanie ćwiczeń (60 minut biegu przy 80% VO2 max) około 4 godziny po zakończeniu śniadania. Wyzwanie z ćwiczeniami przeprowadzono w klimatyzowanym pomieszczeniu w temperaturze 22 ° C bez wentylatora. Badani byli monitorowani, aby upewnić się, że biegają z 80% VO2 max i nie wolno im było spożywać wody podczas wyzwania. Natychmiast po wyzwaniu ćwiczeniowym uczestnicy spożywali sondy cukrowe. Zmierzono masę ciała, pobrano krew (powysiłkowy LPS w osoczu) i poinstruowano pacjentów, aby zbierali mocz przez następne sześć godzin. Aby ułatwić ponowne nawodnienie i wytwarzanie moczu, badanym polecono uzupełnianie 150% utraty płynów (masa ciała przed i po wysiłku) piciem wody.

Po przebadaniu 20 osób populacja piętnastu osób zgodziła się wziąć udział w próbie krzyżowej. Jedna osoba zrezygnowała z udziału z powodu ciąży, a cztery osoby mogły wziąć udział z powodu konfliktów w harmonogramie. Jeden uczestnik zrezygnował z udziału w badaniu po złamaniu kostki, które nie było związane z badaniem.

Trzecia i czwarta wizyta były krzyżową częścią eksperymentu porównującego MFGM z pojazdem. Wizyta 3. i 4. była identyczna z wizytą 2., z wyjątkiem tego, że uczestnicy wypili płyn zastępujący nośnik lub płyn zastępczy + MFGM 1 godzinę przed prowokacją do ćwiczeń i ponownie bezpośrednio po ćwiczeniu. Uczestnicy i personel zarządzający protokołami eksperymentalnymi byli zaślepieni na temat leczenia za pomocą kodowanych, nieprzezroczystych pojemników na napoje. Badani kończą czwartą wizytę tydzień później i spożywają napój pojazdu lub pojazd + MFGM.

W części krzyżowej badania sportowcy otrzymywali jeden z dwóch napojów. Napój kontrolny został sformułowany zgodnie z aktualnymi wytycznymi dotyczącymi żywienia sportowców, zarówno przed, jak i po treningu. Zawierał białko serwatkowe, sacharozę, maltodekstryny, aromat czekoladowy i niewielką ilość oleju maślanego. Napój testowy był identyczny pod względem zawartości makroskładników odżywczych, ale zawierał składnik na bazie mleka zwany „globulką globulek tłuszczu mlecznego”. Surowiec ten jest izolowany z produktu ubocznego produkcji masła i jest bogaty w fosfolipidy. Napoje podawano trzy godziny przed próbą wysiłkową, jak również bezpośrednio po niej. Napój testowy zawierał proszek bogaty w MFGM produkowany przez firmę Arla Foods (Lacprodan PL-20), który zawiera około 20% fosfolipidów i 60% białka. W badaniach na myszach Dial i wsp. zauważyli wpływ na ochronę jelit w ciągu 1 godziny, gdy zwierzętom podano fosfolipidy w dawce 100 mg/kg masy ciała. Drugi napój był dopasowany pod względem zawartości makroskładników odżywczych, ale nie zawierał proszku fosfolipidowego.

Mierzone punkty końcowe Zmiana przepuszczalności jelita Aby określić spoczynkową, wyjściową przepuszczalność jelit zastosowano metodę Palsa. Ta metoda określa przepuszczalność jelitową poprzez dostarczanie niestrawnych cukrów, laktulozy i ramnozy, oraz szacuje przepuszczalność jelitową i żołądkową przez odzyskiwanie tych sond cukrowych w moczu. W zdrowym nabłonku jelita laktuloza ma bardzo ograniczony transport przez barierę jelitową. Ramnoza przenika przez nabłonek jelita cienkiego drogą przezkomórkową i służy jako kontrola wewnętrzna w celu uwzględnienia szybkości opróżniania żołądka, czasu pasażu jelitowego i czynności nerek. Większa cząsteczka laktulozy może przechodzić przez nabłonek jelita tylko drogą parakomórkową przez wąskie połączenia. Dlatego wyższy stosunek laktulozy do ramnozy wykrywany w moczu wskazuje na upośledzoną funkcję bariery jelitowej. Wykazano, że wysiłek fizyczny znacząco zwiększa stosunek laktulozy do ramnozy w moczu. Podobnie jak w naszym proponowanym modelu stresu wysiłkowego, ta metoda została wykorzystana do wykazania, że ​​bieganie przy 80% VO2max przez godzinę podwaja przepuszczalność jelit w porównaniu z wartością wyjściową.

Zmiana LPS w osoczu: Aby ocenić endotoksemię, mierzono stężenia LPS w osoczu za pomocą aktywności kinetycznej, jak opisał Nieman. LPS w osoczu mierzono z krwi pobranej przed wysiłkiem (linia wyjściowa), bezpośrednio po nim oraz 1 i 5 godzin po próbie wysiłkowej. Wykazano, że poziom LPS w osoczu wzrasta po ćwiczeniach wytrzymałościowych i przypuszcza się, że jest to wynikiem nieprawidłowej translokacji bakterii jelitowych przez uszkodzoną barierę jelitową. Podwyższony poziom LPS w osoczu w stosunku do wartości wyjściowych bezpośrednio po wysiłku wykazano wcześniej po półmaratonie, pełnym maratonie. Przewidywano, że poziom LPS w osoczu wzrośnie po wysiłku fizycznym i będzie skorelowany z temperaturą ciała oraz wskaźnikiem integralności bariery jelitowej laktulozy/ramnozy.

Zmiana w cytokinach zapalnych: Poziomy IL-6, TNFα, IL-10, IL-17, INFγ, IL-3, MCP-1, IL-15 i GMCSF w osoczu zmierzono na początku badania oraz w próbkach pobranych 1 godzinę po wysiłku . Stężenia cytokin określono za pomocą multipleksowego testu immunoenzymatycznego (ELISA) przez sprzedawcę komercyjnego (Quansys Biosystems, Logan, UT). Te cytokiny zostały wybrane na podstawie wcześniejszego badania nieszczelności jelit i zużycia MFGM w próbie nieszczelności jelit stymulowanej LPS na myszach. Wszystkie cytokiny były znacząco podwyższone u zwierząt z nieszczelnymi jelitami, z wyjątkiem GMCSF, i były znacząco obniżone u zwierząt karmionych MFGM w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto Ng i wsp. wykazali zwiększone poziomy IL-10 i IL-6 w osoczu (odpowiednio 50% i 65,2% wzrost w stosunku do wartości wyjściowych) u biegaczy bezpośrednio po półmaratonie. Podobnie wykazano, że poziom IL-6 i TNFα w osoczu wzrasta bezpośrednio po maratonie w stosunku do wartości wyjściowych. Na podstawie wstępnych danych i wyżej wymienionych badań przewidywano, że po prowokacji wysiłkowej zostanie zmierzony podwyższony poziom cytokin zapalnych i postawiono hipotezę, że MFGM zniesie ten efekt w porównaniu z innymi napojami regeneracyjnymi.

Zmiana w osoczu kinazy kreatynowej: Kinazę kreatynową mierzono w próbkach pobranych przed, bezpośrednio po i 1 godzinę po prowokacji wysiłkowej. Kinazę kreatynową mierzono za pomocą dostępnego w handlu zestawu kolorymetrycznego (Sigma) w 96-studzienkowym czytniku płytek UV/vis (Molecular Devices). Zwiększona aktywność kinazy kreatynowej w osoczu jest dobrze znanym wskaźnikiem uszkodzeń mięśni wywołanych wysiłkiem fizycznym. W podobnym badaniu rowerzyści jadący z 85% VO2 max do wyczerpania po wyczerpaniu glikogenu poprzedniego dnia mieli mniej kinazy kreatynowej w osoczu, kiedy spożywali mleko czekoladowe jako napój regeneracyjny w porównaniu z napojem zastępującym węglowodany.

Mleczan w osoczu: W celu oceny metabolizmu beztlenowego, poziom mleczanu w osoczu zostanie zmierzony na początku badania, bezpośrednio po wysiłku fizycznym i 2 godziny po nim. Mleczany będą mierzone przy użyciu zestawu testów enzymatycznych (r-Biopharm, Marshall, MI).

Pierwszorzędowym punktem końcowym mierzonym w tym badaniu był stosunek laktulozy do ramnozy w moczu i LPS w osoczu. Dane przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a istotne różnice zbadano za pomocą testów post-hoc. Temperaturę wewnętrzną ciała mierzono w czasie rzeczywistym i skorelowano z niedotlenieniem jelit i nieszczelnością jelit.

Wszystkie składniki mierzone we krwi (mleczany, LPS, cytokiny i CK) analizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA z czasem i leczeniem jako zmiennymi. Uwzględniono mleczan, ponieważ jest on powszechnie uważany za wskaźnik aktywności beztlenowej. Kolejnym parametrem, który nas interesował, jest kinaza kreatynowa. Jak wspomniano we wstępie, enzym ten jest wykrywany we krwi po intensywnym wysiłku fizycznym i uważa się, że koreluje z uszkodzeniem mięśni. Co więcej, co najmniej dwa badania z mlekiem czekoladowym wykazały, że CK w osoczu jest niższa u sportowców pijących mleko czekoladowe w porównaniu z innymi napojami regeneracyjnymi.

Plan zarządzania Wszyscy trzej PI byli aktywnie zaangażowani w planowanie i wykonanie tego badania, a także w przetwarzanie próbek i analizę. Za recepturę napoju MFGM odpowiadał dr Ward. Ponadto dr Ward był odpowiedzialny za analizę moczu metodą GC-FID. Ponadto dr Ward będzie nadzorować studenta wspieranego przez ten projekt.

Dr Bressel rekrutował sportowców i pomagał w organizacji testów. Ponadto dr Bressel nadzorował wszystkie próby wydolnościowe i zbieranie danych dotyczących ćwiczeń.

Dr Hintze był odpowiedzialny za próbki krwi i moczu. Student (i być może dr Hintze) przeprowadził testy LPS, mleczanu i CK. Ponadto dr Hintze był odpowiedzialny za prawidłowe przekazanie próbki krwi oraz dostarczenie próbki do Quansys Biosystems w celu analizy cytokin.

Wszyscy trzej PI współpracowali przy analizie danych i przygotowaniu manuskryptu.