Sérové ​​a buněčné biomarkery pro stenózu aortální chlopně (AthenaValve)

Ukládání vápenatých solí v arteriální stěně a srdečních chlopních je běžně se vyskytující jev spojený s přibývajícím věkem a různými patologickými faktory. Konkrétním případem je kalcifikace aortální chlopně, která je doprovázena postupnou stenózou vedoucí k srdečnímu selhání. V důsledku toho způsobuje významnou morbiditu a dramatický nárůst úmrtnosti, pokud není léčena chirurgicky nebo pomocí transkatétrové intervence. Postihuje přibližně 2 % populace nad 65 let a je třetí příčinou úmrtí v této populaci. Čítá asi 100 operací na 100 000 osoboroků v dekádě a 180 000 pacientů ročně je kandidáty na implantaci perkutánní aortální chlopně (TAVI) v USA, Kanadě a Evropské unii.

Charakteristické pro toto onemocnění je, že i dnes zůstává bez diagnózy v kritických raných stádiích a všechny existující terapie nedokázaly zpomalit nebo zvrátit poškození při aplikaci v konečných stádiích. Předchozí experimentální studie naznačovaly, že existující léky mohou být účinnější, pokud jsou podávány v raném stádiu onemocnění. V době, kdy je aortální stenóza evidentní na echokardiografii nebo počítačové tomografii (CT), základní biochemické a molekulární léze se již vyvinuly. Navíc u pacientů se stenózou aortální chlopně není známo, kdo se rychle vyvine k dynamickému zúžení chlopně, a předchozí výzkumné studie uvádějí významně rozdílnou míru progrese mezi pacienty, přičemž přibližně 20–25 % vykazuje více než dvojnásobnou míru. Achillovou patou terapeutického managementu pacientů je tedy absence včasné diagnózy a prognózy progrese onemocnění.

Při kombinaci patologických vlivů faktorů, jako je hypertenze, diabetes mellitus a dyslipidémie, dochází u pacientů s možnou genetickou predispozicí k narušení normální struktury a funkce endotelu, což progresivně vede k onemocnění základní tkáně chlopně. Lokální acidóza a hromadění oxidačních kyslíkových radikálů způsobuje poškození membránových fosfolipidů, oxidaci cholesterolu a proteinů, které ztrácejí svou normální kvartérní strukturu a degradují. Postupné ukládání solí fosfátu a uhličitanu vápenatého na patologické proteiny vede ke kalcifikaci tkáně chlopně. Intenzivní zánětlivá reakce s aktivací kostní dřeně a infiltrací tkáně imunokompetentními buňkami provází poškození: makrofágy, B a T lymfocyty, mastocyty infiltrují a aktivně přispívají k onemocnění. V tomto prostředí zánětlivé cytokiny vylučované ze zánětlivých buněk vedou k aktivaci embryonálních buněčných drah, které pomáhají dále posílit kalcifikaci prostřednictvím přeměny rezidentních fibroblastů na aktivní osteoblasty, které aktivně ukládají vápenaté soli prostřednictvím extracelulárních vezikul.

Na onemocnění se podílí více typů buněk a vzdálených orgánů (játra - metabolismus cholesterolu, slezina a kostní dřeň - aktivace imunitní reakce) a při poškození se předpokládá uvolnění fragmentů biologických a biochemických látek v krevním oběhu. Proto se očekává, že se onemocnění odrazí ve změnách sérového proteinu. U vhodně vybraných pacientů, prospektivně zařazených a monitorovaných v průběhu stenózy aortální chlopně, je možné detekovat proteiny a metabolity v krevním séru. Optimální popis podskupiny pacientů s rychlou nebo pomalou progresí onemocnění může odhalit důležité informace pro budoucí klinické diagnostické a prognostické použití. Kromě toho je onemocnění charakterizováno buněčnou infiltrací velkého množství známých i neznámých imunitních buněk, které přispívají k onemocnění. Objev nových buněčných fenotypů spojených s progresí onemocnění tedy může pomoci vymezit důležité klinické aspekty.

Účely Athena Valve jsou:

(A) Sběr dat o progresi kalcifikace a stenóze aortální chlopně, popis subpopulací s rychlou a pomalou progresí a záznam klinických příhod.

(B) Bioinformatická analýza dat z kombinované transkriptomiky-metabolomiky-proteomiky nemocného zvířecího modelu tkáně aortální chlopně v časném, středním a konečném stadiu, ve srovnání s existujícími pacientskými multi-omickými databázemi, za účelem zkoumání kandidátských molekul - "driverů" “ o škodě s příčinnou souvislostí.

(C) Diferenciální proteomická analýza vzorků sér pacientů s těžkou stenózou aortální chlopně, retrospektivně definovanou jako rychlá versus pomalá progrese onemocnění a kontrolní skupina jedinců bez stenózy aortální chlopně a těžké kalcifikace.

(D) Diferenciální metabolomická analýza vzorků sér pacientů s těžkou stenózou aortální chlopně, retrospektivně definovanou jako rychlá versus pomalá progrese onemocnění a kontrolní skupina jedinců bez stenózy aortální chlopně a těžké kalcifikace.

(E) Získat rozdílný profil cirkulujících imunitních buněk mezi pacienty.

(F) Integrovaná bioinformatická analýza dat diferenciálního sérového proteomu a metabolomu pacientů obohacená o výsledky zvířecího modelu a existující databáze od jiných pacientů, k určení nejpravděpodobnějších - kauzálně příbuzných molekul s progresí onemocnění v molekulární síti.

(G) Využití důležitějších proteinových cílů pro vývoj nového detekčního testu pro více proteinových cílů v krevním séru pomocí multiplexní ELISA na základě výsledků bioinformatické analýzy.

(H) Aplikace nového testu multiplex ELISA ve vzorcích párového séra pacientů se středně těžkou až těžkou stenózou aorty a kontrolní skupina jedinců bez stenózy aortální chlopně a těžké kalcifikace, prospektivně zařazených a monitorovaných, úvodní validace testu a revize jeho diagnostiky výkon.

Stručná metodika:

Dvě nezávislé klinické kohorty poskytnou potřebná data a vzorky séra. První, retrospektivní kohorta pacientů s těžkou stenózou aortální chlopně bude definovat sérové, echokardiografické a klinické rozdíly mezi podskupinami s různou mírou progrese. Druhá kohorta, prospektivně vyvinutá, potvrdí retrospektivně získaná klinická a echokardiografická data a poskytne základní a následná měření kalcifikace aortální chlopně (CT kalciové skóre). Spárované základní a následné vzorky séra ověří cílové hodnoty séra z retrospektivní kohorty. Pacienti budou každoročně vyšetřeni echokardiografií a kontrolním CT po 2 a 5 letech od zařazení.

Retrospektivní proteomika bude prováděna s necílenou kapalinovou chromatografií/hmotnostní spektrometrií (LC/MS) a metabolomika s necílenou kapalinovou chromatografií-tandemová hmotnostní spektrometrie (LC-MS/MS) v režimu sériového sledování reakce (SRM). Prospektivní proteomika a metabolomika bude kvantitativní a cílená. Vzorky krve budou okamžitě zmraženy a skladovány při -80 C.

Kromě toho budou mononukleární buňky periferní krve izolovány a kryokonzervovány při -80 C s diferenciální hustotou centrifugace. Populace buněk budou analyzovány pomocí hmotnostní cytometrie, průtokové cytometrie, třídění buněk a molekulárních metod.

Pro patofyziologické obohacení bude použit modifikovaný novozélandský králičí model pro aortální stenózu v longitudinálním protokolu odběru tkáně v časném, středním a pozdním stádiu onemocnění (odpovídající zánětu – kalcifikaci a následné stenóze chlopně).