Surowicze i komórkowe biomarkery zwężenia zastawki aortalnej (AthenaValve)

Odkładanie się soli wapnia w ścianie tętnicy i zastawkach serca jest zjawiskiem powszechnie występującym, związanym z wiekiem i różnymi czynnikami patologicznymi. Szczególnym przypadkiem jest zwapnienie zastawki aortalnej, któremu towarzyszy stopniowe zwężenie prowadzące do niewydolności serca. W rezultacie powoduje znaczną chorobowość i dramatyczny wzrost śmiertelności, jeśli nie jest leczony chirurgicznie lub przezcewnikowo. Dotyka około 2% populacji powyżej 65 roku życia i jest trzecią przyczyną zgonów w tej populacji. Liczba operacji wynosi około 100 na 100 000 osobolat w ciągu dekady, a każdego roku 180 000 pacjentów jest kandydatami do przezskórnej implantacji zastawki aortalnej (TAVI) w Stanach Zjednoczonych, Kanadzie i Unii Europejskiej.

Cechą charakterystyczną tej choroby jest to, że nawet dzisiaj pozostaje ona bez diagnozy w krytycznych wczesnych stadiach, a wszystkie istniejące terapie nie spowalniają ani nie odwracają uszkodzeń, gdy są stosowane w końcowych stadiach. Wcześniejsze badania eksperymentalne sugerowały, że istniejące leki mogą być bardziej skuteczne, jeśli zostaną podane na wczesnym etapie choroby. W momencie, gdy zwężenie zastawki aortalnej staje się widoczne w badaniu echokardiograficznym lub tomografii komputerowej (CT), podstawowe zmiany biochemiczne i molekularne już się rozwinęły. Co więcej, wśród pacjentów ze zwężeniem zastawki aortalnej nie wiadomo, kto szybko rozwinie się do dynamicznego zwężenia zastawki, a wcześniejsze badania naukowe wskazują na znacznie zróżnicowane wskaźniki progresji wśród pacjentów, przy czym około 20-25% wykazuje więcej niż dwukrotność wskaźników. Piętą achillesową postępowania terapeutycznego z pacjentami jest zatem brak wczesnej diagnozy i prognozy progresji choroby.

W wyniku połączenia efektów patologicznych takich czynników jak nadciśnienie, cukrzyca i dyslipidemia u pacjentów z możliwymi predyspozycjami genetycznymi dochodzi do upośledzenia prawidłowej budowy i funkcji śródbłonka, co stopniowo prowadzi do choroby leżącej poniżej tkanki zastawki. Miejscowa kwasica i nagromadzenie oksydacyjnych rodników tlenowych powoduje uszkodzenie fosfolipidów błonowych, utlenianie cholesterolu i białek, które tracą swoją normalną czwartorzędową strukturę i ulegają degradacji. Stopniowe osadzanie się soli fosforanowych i węglanowych na patologicznych białkach prowadzi do zwapnienia tkanki zastawki. Uszkodzeniu towarzyszy intensywna reakcja zapalna z aktywacją szpiku i naciekiem tkanki przez komórki immunokompetentne: makrofagi, limfocyty B i T, mastocyty naciekają i aktywnie uczestniczą w chorobie. W tym środowisku cytokiny zapalne wydzielane z komórek zapalnych prowadzą do aktywacji szlaków komórek embrionalnych, które pomagają w dalszym zwiększaniu zwapnienia poprzez konwersję rezydentnych fibroblastów w aktywne osteoblasty, które aktywnie odkładają sole wapnia przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.

W chorobie bierze udział wiele typów komórek i odległych narządów (wątroba - metabolizm cholesterolu, śledziona i szpik kostny - aktywacja odpowiedzi immunologicznej), a uszkodzenie ma spowodować uwolnienie fragmentów substancji biologicznych i biochemicznych do krwioobiegu. W związku z tym oczekuje się, że choroba znajdzie odzwierciedlenie w zmianach w białku w surowicy. Wykrywanie białek i metabolitów w surowicy krwi jest możliwe u odpowiednio dobranych pacjentów, włączonych prospektywnie i monitorowanych pod kątem przebiegu zwężenia zastawki aortalnej. Optymalny opis podgrupy pacjentów z szybkim lub powolnym postępem choroby może ujawnić ważne informacje dla przyszłego klinicznego zastosowania diagnostycznego i prognostycznego. Ponadto choroba charakteryzuje się infiltracją komórkową mnóstwa znanych i nieznanych komórek odpornościowych, które przyczyniają się do choroby. Zatem odkrycie nowych fenotypów komórkowych związanych z postępem choroby może pomóc w określeniu ważnych aspektów klinicznych.

Cele Athena Valve to:

(A) Zbieranie danych dotyczących postępu zwapnienia i zwężenia zastawki aortalnej, opis subpopulacji z szybkim i wolnym postępem oraz zapis zdarzeń klinicznych.

(B) Bioinformatyczna analiza danych z połączonej transkryptomiki, metabolomiki i proteomiki chorego zwierzęcego modelu tkanki zastawki aortalnej we wczesnych, pośrednich i końcowych stadiach, w porównaniu z istniejącymi bazami danych multiomiki pacjentów, w celu zbadania potencjalnych molekuł - „sterowników „szkody ze związkiem przyczynowym.

(C) Różnicowa analiza proteomiczna próbek surowic pacjentów z ciężkim zwężeniem zastawki aortalnej, retrospektywnie zdefiniowanych jako szybka i wolna progresja choroby oraz grupa kontrolna osób bez zwężenia zastawki aortalnej i ciężkiego zwapnienia.

(D) Różnicowa analiza metabolomiczna próbek surowic pacjentów z ciężkim zwężeniem zastawki aortalnej, retrospektywnie zdefiniowanych jako osoby z szybkim i wolnym postępem choroby oraz grupa kontrolna osób bez zwężenia zastawki aortalnej i ciężkiego zwapnienia.

(E) Aby uzyskać zróżnicowany profil krążących komórek odpornościowych wśród pacjentów.

(F) Zintegrowana analiza danych bioinformatycznych różnicowego proteomu i metabolomu surowicy pacjenta, wzbogacona o wyniki modelu zwierzęcego i istniejące bazy danych innych pacjentów, w celu określenia najbardziej prawdopodobnych - powiązanych przyczynowo cząsteczek z postępem choroby w sieci molekularnej.

(G) Wykorzystanie ważniejszych celów białkowych do opracowania nowego testu wykrywania wielu celów białkowych w surowicy krwi metodą multipleksowego testu ELISA w oparciu o wyniki analizy bioinformatycznej.

(H) Zastosowanie nowego testu multipleks ELISA w sparowanych próbkach surowicy pacjentów z umiarkowanym do ciężkiego zwężenia zastawki aortalnej i grupy kontrolnej osób bez zwężenia zastawki aortalnej i ciężkiego zwapnienia, prospektywnie włączonych i monitorowanych, wstępna walidacja testu i przegląd jego diagnostycznych wydajność.

Krótka metodologia:

Dwie niezależne kohorty kliniczne dostarczą niezbędnych danych i próbek surowicy. Pierwsza, retrospektywna kohorta pacjentów z ciężkim zwężeniem zastawki aortalnej, określi surowicze, echokardiograficzne i kliniczne różnice między podgrupami o różnych wskaźnikach progresji. Druga kohorta, opracowana prospektywnie, potwierdzi retrospektywnie uzyskane dane kliniczne i echokardiograficzne oraz zapewni pomiary wyjściowe i kontrolne zwapnień zastawki aortalnej (wynik wapnia w CT). Sparowane próbki surowicy wyjściowej i kontrolnej potwierdzą docelowe wartości surowicy z kohorty retrospektywnej. Pacjenci będą oceniani za pomocą echokardiografii raz w roku i kontrolnej tomografii komputerowej po 2 i 5 latach od włączenia.

Retrospektywna proteomika zostanie przeprowadzona za pomocą nieukierunkowanej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas (LC/MS), a metabolomika za pomocą nieukierunkowanej chromatografii cieczowej-tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS) w trybie monitorowania reakcji seryjnej (SRM). Prospektywna proteomika i metabolomika będą ilościowe i ukierunkowane. Próbki krwi zostaną natychmiast zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 C.

Ponadto komórki jednojądrzaste krwi obwodowej zostaną wyizolowane i poddane kriokonserwacji w temperaturze -80 C z zastosowaniem wirowania w różnych gęstościach. Populacje komórek będą analizowane z wykorzystaniem cytometrii masowej, cytometrii przepływowej, sortowania komórek i metod molekularnych.

Dla wzbogacenia patofizjologicznego, zmodyfikowany model zwężenia zastawki aortalnej królika nowozelandzkiego zostanie wykorzystany w podłużnym protokole pobierania tkanek we wczesnym, pośrednim i późnym stadium choroby (odpowiadającym zapaleniu - zwapnieniu i późniejszemu zwężeniu zastawki).