Biomarcatori sierici e cellulari per la stenosi della valvola aortica (AthenaValve)

La deposizione di sali di calcio nella parete arteriosa e nelle valvole cardiache è un fenomeno comune associato all'avanzare dell'età ea vari fattori patologici. Un caso particolare è la calcificazione della valvola aortica, che si accompagna a stenosi graduale che porta allo scompenso cardiaco. Di conseguenza, provoca una significativa morbilità e un drammatico aumento della mortalità se non trattata chirurgicamente o tramite intervento transcatetere. Colpisce circa il 2% della popolazione di età superiore ai 65 anni, essendo la terza causa di morte in questa popolazione. Conta circa 100 interventi chirurgici per 100.000 anni-persona nel decennio e 180.000 pazienti ogni anno sono candidati per l'impianto di valvola aortica percutanea (TAVI) negli Stati Uniti, in Canada e nell'Unione Europea.

Caratteristica della malattia è che rimane ancora oggi senza una diagnosi nelle prime fasi critiche e tutte le terapie esistenti non sono riuscite a rallentare o invertire il danno quando applicate nelle fasi finali. Precedenti studi sperimentali hanno suggerito che i farmaci esistenti potrebbero essere più efficaci se somministrati all'inizio del decorso della malattia. Nel momento in cui la stenosi aortica diventa evidente all'ecocardiografia o alla tomografia computerizzata (TC), si sono già sviluppate lesioni biochimiche e molecolari sottostanti. Inoltre, tra i pazienti con stenosi della valvola aortica, non è noto chi evolverà rapidamente verso un restringimento dinamico della valvola e studi di ricerca precedenti riportano tassi di progressione significativamente diversi tra i pazienti, con circa il 20-25% che dimostra tassi più che doppi. Pertanto, il tallone d'Achille della gestione terapeutica dei pazienti è la mancanza di diagnosi precoce e prognosi della progressione della malattia.

Sotto una combinazione di effetti patologici di fattori quali ipertensione, diabete mellito e dislipidemia in pazienti con una possibile predisposizione genetica, si verifica una compromissione della normale struttura e funzione dell'endotelio, che porta progressivamente alla malattia del tessuto valvolare sottostante. L'acidosi locale e l'accumulo di radicali ossidativi dell'ossigeno causano danni ai fosfolipidi di membrana, ossidazione del colesterolo e delle proteine, che perdono la loro normale struttura quaternaria e si degradano. La deposizione graduale di sali di fosfato e di carbonato di calcio sulle proteine ​​patologiche porta alla calcificazione del tessuto valvolare. Al danno si accompagna un'intensa reazione infiammatoria con attivazione del midollo osseo e infiltrazione di tessuto con cellule immunocompetenti: macrofagi, linfociti B e T, mastociti si infiltrano e contribuiscono attivamente alla malattia. All'interno di questo ambiente, le citochine infiammatorie secrete dalle cellule infiammatorie portano all'attivazione di percorsi cellulari embrionali che aiutano a migliorare ulteriormente la calcificazione attraverso la conversione dei fibroblasti residenti in osteoblasti attivi, che depositano attivamente sali di calcio attraverso le vescicole extracellulari.

Nella malattia sono coinvolti più tipi cellulari e organi distanti (fegato - metabolismo del colesterolo, milza e midollo osseo - attivazione della risposta immunitaria) e si prevede che il danno rilasci frammenti di sostanze biologiche e biochimiche nella circolazione sanguigna. Pertanto, si prevede che la malattia si rifletta nei cambiamenti nelle proteine ​​sieriche. È possibile rilevare proteine ​​e metaboliti nel siero del sangue in pazienti opportunamente selezionati, arruolati in modo prospettico e monitorati durante il decorso della stenosi della valvola aortica. Una descrizione ottimale del sottogruppo di pazienti con progressione rapida o lenta della malattia può rivelare informazioni importanti per il futuro uso clinico diagnostico e prognostico. Inoltre, la malattia è caratterizzata dall'infiltrazione cellulare di una pletora di cellule immunitarie conosciute e sconosciute che contribuiscono alla malattia. Pertanto, la scoperta di nuovi fenotipi cellulari legati alla progressione della malattia può aiutare a delineare importanti aspetti clinici.

Gli scopi di Athena Valve sono:

(A) Raccolta di dati sulla progressione della calcificazione e della stenosi della valvola aortica, descrizione delle sottopopolazioni con progressione rapida e lenta e registrazione degli eventi clinici.

(B) L'analisi bioinformatica dei dati combinati di trascrittomica-metabolomica-proteomica del tessuto della valvola aortica modello animale malato nelle fasi iniziali, intermedie e finali, rispetto ai database multi-omici dei pazienti esistenti, al fine di studiare le molecole candidate - "driver" "del danno con nesso di causalità.

(C) L'analisi proteomica differenziale dei campioni di siero dei pazienti con grave stenosi della valvola aortica, definiti retrospettivamente come progressivi della malattia rapidi rispetto a lenti e gruppo di controllo di individui senza stenosi della valvola aortica e grave calcificazione.

(D) L'analisi metabolomica differenziale dei campioni di siero dei pazienti con grave stenosi della valvola aortica, definiti retrospettivamente come progressivi della malattia rapidi rispetto a quelli lenti e gruppo di controllo di individui senza stenosi della valvola aortica e grave calcificazione.

(E) Per ottenere il profilo differenziale delle cellule immunitarie circolanti tra i pazienti.

(F) L'analisi integrata dei dati bioinformatici del proteoma e del metaboloma sierici differenziali del paziente arricchiti con i risultati del modello animale e dei database esistenti di altri pazienti, per determinare le molecole più probabili - causalmente correlate con la progressione della malattia in una rete molecolare.

(G) Utilizzo dei bersagli proteici più importanti per lo sviluppo di un nuovo test di rilevamento per bersagli proteici multipli nel siero del sangue mediante ELISA multiplex basato sui risultati dell'analisi bioinformatica.

(H) Applicazione del nuovo saggio ELISA multiplex in campioni di siero accoppiati di pazienti con stenosi aortica da moderata a grave e gruppo di controllo di individui senza stenosi della valvola aortica e calcificazione grave, arruolati e monitorati in modo prospettico, validazione iniziale del saggio e revisione della sua diagnosi prestazione.

Breve metodologia:

Due coorti cliniche indipendenti forniranno i dati necessari e i campioni di siero. Il primo, una coorte retrospettiva di pazienti con grave stenosi della valvola aortica definirà le differenze sieriche, ecocardiografiche e cliniche tra i sottogruppi con diversi tassi di progressione. La seconda coorte, sviluppata in modo prospettico, confermerà i dati clinici ed ecocardiografici ottenuti in modo retrospettivo e fornirà misurazioni al basale e al follow-up della calcificazione della valvola aortica (punteggio di calcio CT). I campioni di siero accoppiati al basale e al follow-up convalideranno i bersagli sierici dalla coorte retrospettiva. I pazienti saranno valutati con ecocardiografia ogni anno e con follow-up CT a 2 e 5 anni dall'arruolamento.

La proteomica retrospettiva verrà eseguita con cromatografia liquida/spettrometria di massa non mirata (LC/MS) e la metabolomica con cromatografia liquida non mirata-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) in modalità SRM (Serial Reaction Monitoring). La proteomica e la metabolomica prospettiche saranno quantitative e mirate. I campioni di sangue saranno immediatamente congelati e conservati a -80 C.

Inoltre, le cellule mononucleari del sangue periferico saranno isolate e crioconservate a -80°C mediante centrifugazione a densità differenziale. Le popolazioni cellulari saranno analizzate utilizzando citometria di massa, citometria a flusso, cernita cellulare e metodi molecolari.

Per l'arricchimento fisiopatologico, un modello di coniglio neozelandese modificato per la stenosi aortica verrà utilizzato in un protocollo longitudinale di prelievo di tessuto nella malattia in fase iniziale, intermedia e avanzata (corrispondente all'infiammazione - calcificazione e successiva stenosi valvolare).