Periimplantitida a MMP-8

Zubní implantáty se v posledních desetiletích staly nedílnou součástí moderní stomatologie. Od doby, kdy byla objevena osseointegrace (proces zabudování implantátu do čelistní kosti), prošla implantologická stomatologie v průběhu času podstatnými kroky. Zubní implantáty se skládají z endosteální části z titanu a zevní protetické části, pomáhající při rehabilitaci bezzubých pacientů. Nabízejí možnost pacientům, kterým chybí jeden nebo více zubů, k dosažení maximálních funkčních a estetických výsledků, upustit od tradičních zubních protéz, které jsou značně nepříjemné. Průmysl implantátů postupně roste. Celkově byl celosvětový trh dentálních implantátů v roce 2016 oceněn na 2,91 miliardy USD, přičemž v USA bylo ročně umístěno více než 8,809 milionů implantátů (1). Prevalence biologických komplikací u náhrad s podporou dentálních implantátů však roste stejným tempem (1).

Termín „peri-implantitida“ byl zaveden na 1. evropském workshopu parodontologie v roce 1994 a od té doby bylo navrženo mnoho definic popisujících ztrátu kostní hmoty, která charakterizuje následky instalace implantátu [2,3]. Periimplantitida a periimplantační mukozitida jsou zahrnuty pod termín periimplantační onemocnění a jsou považovány za analogické s periodontálními onemocněními (4). V současné době je periimplantitida definována jako patologický stav kolem zubních implantátů charakterizovaný zánětem sliznice periimplantátu a progresivním úbytkem kostní hmoty, který případně ohrožuje osud implantátu (5). Počet studií týkajících se periimplantitidy podle PubMed za posledních 30 let vzrostl z 86 prací v 90. letech na celkový počet 1938 rukopisů až do současnosti (1). Prevalence periimplantitidy také vykazuje rostoucí míru. V systematickém přehledu Zitzman a Berglundh v roce 2008 uvedli prevalenci v rozmezí od 12 do 56 % (3). Novější studie odhalily prevalenci 22 % (1–47 %) (6), 20 % (7), 26 % (8) a 28 % (9). Je třeba poukázat na to, že v předchozích studiích je obtížné odhadnout přesnou prevalenci onemocnění a závisí na několika faktorech, včetně diagnostických kritérií onemocnění a časového bodu zvoleného pro hodnocení (10). Je však zřejmé, že periimplantitida je rostoucí problém ovlivňující implantologii a bude jistě tématem mnoha budoucích studií.

Pro léčbu periimplantitidy bylo navrženo několik protokolů včetně nechirurgických protokolů se zařízeními na dekontaminaci implantátů a lasery a chirurgických protokolů, jako je použití regeneračních materiálů [11,12]. Pokud je však periimplantitida již prokázaná, lze navrhované strategie a doporučení pro její léčbu stále považovat za empirické. Z existujících důkazů se zdá, že nechirurgická terapie není účinná, alespoň ne v pokročilých případech. Chirurgické techniky mohou být nezbytné k tomu, abychom měli adekvátní přístup k účinné degranulaci zanícených tkání a také k dekontaminaci povrchu implantátu [13].

Zpráva Consensus pracovní skupiny 4 ze světového workshopu o klasifikaci parodontálních a periimplantátových onemocnění a stavů v roce 2017 dospěla k závěru, že periimplantitida je zánětlivý proces mikrobiálního původu, který způsobuje ztrátu kostní hmoty (4). Kromě toho bylo u této jednotky navrženo několik rizikových faktorů jako potenciálních spolujezdců, včetně anamnézy parodontitidy, kouření, cukrovky a špatné kontroly plaku (5). Faktory, jako je genetická predispozice a uvolňování titanových částic, byly také označeny jako potenciální rizikové faktory (14). Bylo prokázáno mikrobiální zapojení do iniciace a progrese periimplantitidy, nicméně nedávné studie naznačují, že periimplantitida může být důsledkem reakce na cizí těleso, což zdůrazňuje roli reakce hostitele při iniciaci onemocnění. (15). Jinými slovy, etiologie onemocnění musí být ještě objasněna. Pomocí konvenční DNA sondy a kultivačních analýz však byly izolovány běžné parodontopatogenní bakterie na zdravých i nemocných implantačních místech (16) a distribuce detekovaných druhů se podle klinického stavu implantátu výrazně nelišila (17). Ve srovnání se samotnými zdravými implantáty byla periimplantitida spojena s vyšším počtem bakteriálních druhů považovaných za konsensuální periodontální patogeny, včetně Porphyromonas gingivalis a Tannerella forsythia (18). Observační studie navíc ukázaly, že periimplantitida byla častěji spojena s oportunními patogeny, jako jsou Pseudomonas aeruginosa a Staphylococcus aureus,(19,20) houbové organismy (např. Candida albicans, Candida boidinii, Penicillum spp., Rhadotorula laryngis, Paelicomyces spp.), (21,22) a viry (tj. lidský cytomegalovirus, virus Epstein-Barrové, (23), což ukazuje na poměrně komplexní a heterogenní infekci. Rozpoznání přesného bakteriálního složení periimplantátových lézí má proto prvořadý význam.

Významným postřehem ohledně selhání implantátů je, že obvykle malý počet pacientů ztratí mnoho implantátů. Tento fenomén shlukování byl identifikován v mnoha studiích (24,25). Weyant a jeho kolegové zkoumali míru přežití implantátů u 598 pacientů a všimli si, že více než polovina případů, které dostaly více implantátů, měla více než jeden selhání. Odhadli, že pacienti, kteří ztratili jeden implantát, měli o 1,3 vyšší pravděpodobnost, že ztratí více implantátů (26). Tato zjištění vedla k hypotéze, že hostitelské faktory ovlivňují přežití implantátu, a proto genetická predispozice může hrát důležitou roli v rozvoji periimplantitidy. Bylo hodnoceno mnoho genových polymorfismů. Zpočátku se většina studií týkala polymorfismů cytokinů, které hrají klíčovou roli v imunitní odpovědi (27-29), jako jsou interleukiny IL-1α, IL-1β a jejich antagonistický protein IL-1ra, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-a a transformující růstový faktor-pl (TGF-pi). Kromě nich byly zkoumány různé další geny, např. geny kódující CD14, receptorový aktivátor ligandu jaderného faktoru kappa B (RANKL), mikroRNA, kostní morfogenetické proteiny (BMP), fibroblastový růstový faktor (FGF), aktivátor NF-kappa-β (TANK) spojený s členem rodiny TRAF (TANK), serin/threonin -proteinkináza B-Raf (BRAF), kalcitoninový receptor (CTR), haptoglobin. Ve výsledcích výše zmíněných studií je mnoho nesrovnalostí. Některým se podařilo odhalit možné asociace a jiným ne. Novější genový polymorfismus zmíněný v genetických studiích je polymorfismus cyklooxygenázy-2 (COX-2). Ukázalo se, že jednonukleotidový polymorfismus COX-2 mění expresi genu COX-2. Několik studií zjistilo souvislost mezi polymorfismy genu COX-2 a parodontitidou (30-32). V případě periimplantitidy jsou však údaje vzácné.

Diagnóza periimplantitidy je založena na tradičních klinických ukazatelích, podobně jako při hodnocení onemocnění parodontu. Konkrétně je diagnóza stanovena přítomností krvácení a/nebo hnisání při jemném sondování, zvýšenou hloubkou sondování ve srovnání s předchozími klinickými vyšetřeními a přítomností úbytku kostní hmoty nad rámec změn na úrovni hřebenové kosti vyplývající z počáteční remodelace kosti [4]. Nedávné studie však zpochybňují diagnostickou přesnost klinických ukazatelů jako takových a podporují, že diagnostika onemocnění je mnohem složitější (33). V tomto ohledu byly použity nové diagnostické metody, aby bylo dosaženo včasné a správné diagnózy onemocnění (34). Biomarker nebo biologický marker je měřitelný indikátor nějakého biologického stavu nebo stavu. Biomarkery jsou často měřeny a hodnoceny pro zkoumání normálních biologických procesů, patogenních procesů nebo farmakologických odpovědí na terapeutickou intervenci a jsou užitečné při diagnostice a prognóze onemocnění. V případě periimplantitidy bylo vyhodnoceno několik biologických molekul jako potenciálních biomarkerů napomáhajících diagnostice onemocnění. Molekuly jako TNF-a, IL-1, RANKL byly spojovány s periimplantitidou v řadě studií (34). V poslední době si matricová metaloproteináza 8 (MMP-8), zejména ve své aktivní formě (aMMP-8), získala velkou pozornost, protože se stala slibným kandidátem na biomarker pro diagnostiku a hodnocení progrese a průběhu těchto epizodických zánětlivých tkáňových destruktivních a degenerativních onemocnění ( 35,36).

Celkově vzato je periimplantitida komplikované onemocnění s vysokou prevalencí mezi populací. Současná data o etiologii a diagnóze onemocnění jsou navíc kontroverzní.

CÍLE NÁVRHU, STAV TECHNIKY A VÝZVY

1. Řešit vztah periimplantitidy s polymorfismy genu COX-2, protože v literatuře nejsou žádné podobné studie.
2. Identifikovat patogenní mikroflóru, která je spojena s onemocněním, pomocí nových metod bakteriální identifikace.
3. Vyhodnotit diagnostickou přesnost testu aMMP-8 Point-of-care chair-side testu u periimplantitidy.

Důvody pro studium každého ze studovaných cílů budou analyzovány v samostatné části.

- Polymorfismy genu COX-2. Genetická predispozice je považována za potenciální rizikový faktor periimplantitidy, jak již bylo zmíněno. Jednonukleotidový polymorfismus (SNP) je variace jednoho nukleotidu ve specifické poloze genomu. Každá variace se v populaci objevuje v určité míře. SNP se mohou vyskytovat v kódujících a nekódujících sekvencích genů nebo v intergenových oblastech. Vzhledem k degeneraci genetického kódu může SNP v kódující sekvenci změnit aminokyselinovou sekvenci kódujícího polypeptidu (nesynonymní SNP) nebo neovlivňovat proteinovou sekvenci (synonymní SNP). SNP mimo oblasti kódující protein mohou stále regulovat genovou expresi prostřednictvím ovlivnění vazby transkripčního faktoru, sestřihu genu, degradace mRNA nebo sekvence nekódující RNA. Proto jsou SNP základem rozdílů v naší náchylnosti k nemocem. SNP genů pro zánětlivé cytokiny mohou ovlivnit úrovně jejich exprese nebo aminokyselinovou sekvenci a následně zánětlivou odpověď hostitele.

COX-2 přeměňuje kyselinu arachidonovou na prostaglandin H2, který je prekurzorem prostaglandinu E2. Prostaglandin E2, který zprostředkovává prozánětlivé a protizánětlivé reakce v mnoha tkáních (37), je také částečně zodpovědný za aktivační procesy podílející se na resorpci alveolární kosti během patogeneze parodontitidy. Asociace genu cyklooxygenázy 2 (COX-2) s parodontitidou byly poprvé identifikovány v tchajwanské a čínské populaci case-control (30,31) a následně validovány v populaci severozápadní Evropy. Studie jako takové zahrnující gen COX-2 nebyly v případě periimplantitidy dosud provedeny. Nedávná studie genové exprese však odhalila zvýšenou aktivitu dráhy COX-2 v případě periimplantitidy (38,39), což naznačuje, že COX-2 může hrát důležitou roli v patogenezi periimplantitidy. Spojení periimplantitidy s určitými genovými polymorfismy umožní lepší pochopení onemocnění, což povede k účinnějším strategiím prevence a léčby.

• Mikrobiální faktory spojené s periimplantitidou Současná data potvrzují, že periimplantačním infekcím dominují gramnegativní bakterie, podobně jako periodontální infekce, ale některé případy mohou obsahovat odlišnou mikroflóru (20,40,41). Ačkoli dřívější zprávy ukázaly podobnosti mezi periimplantátovou a periodontální flórou, pozdější studie prokázaly, že periimplantitidové léze mohou představovat nejen konsensuální periodontální patogeny, ale také oportunní mikroorganismy, jako jsou S. aureus, S. anaerobius, Escherichia coli, Candida a Streptococci spp (18). Kromě toho metody sekvenování také odhalily další nekultivovatelné mikroorganismy spojené s onemocněním periimplantátu. Byly identifikovány asacharolytické anaerobní grampozitivní tyčinky (AAGPR), jako jsou Eubacterium nodatum, Eubacterium brachy, Slackia exigua, Gemella sanguinis a anaerobní gramnegativní tyčinky (OGNR) jako Mitsuokella sp., Treponema lecitinolyticum (42). Nesrovnalosti mezi těmito studiemi mohou vyplývat z různých metod používaných pro mikrobiologické odběry vzorků a zpracování (43). Mikrobiologický profil periimplantátových onemocnění zůstává předmětem zájmu a bylo provedeno mnoho výzkumů a přehledů s cílem učinit závěr, zda se mikroflóra liší od mikrobioty parodontitidy; kontroverze však stále existují. Poslední studie dospěla k závěru, že neexistují dostatečné důkazy, které by podporovaly odlišnou mikroflóru mezi periimplantátovými a periodontálními onemocněními (44,45), zatímco jiné uvádějí, že z hlediska mikrobiologického profilu mohou jít o různé entity (43). Proto je třeba provést další studie, aby bylo možné definovat mikrobiologický profil periimplantátových tkání. Pro tento účel by byly velmi užitečné nejnovější technologie, jako je brokovnicové sekvenování celého genomu bakterií účastnících se periimplantitidy, ale žádný takový výzkum nebyl dosud publikován. V této studii tedy bude použito sekvenování nové generace k identifikaci nejhnisavější mikroflóry spojené s onemocněním. Sekvenování 16s rRNA umožní charakterizaci celé taxonomické identity periimplantačních lézí.
• Diagnostická přesnost testu ImplantSafe MMP-8 Biomarker Test. Neutrofilní kolagenáza, také nazývaná matricová metaloproteináza (MMP)-8, polymorfonukleární (PMN) leukocytární kolagenáza nebo kolagenáza-2, byla identifikována a charakterizována jako hlavní kolagenolytický enzym, který způsobuje aktivní periodontální a periimplantátovou degeneraci (APD) u parodontitidy a periimplantitida (46,47). MMP-8 může vyřešit a regulovat zánětlivé a imunologické kaskády zpracováním nematrixových bioaktivních substrátů, jako jsou chemokiny, cytokiny, serpiny a složky komplementu. Fyziologické hladiny MMP-8 mohou vykazovat ochranné a obranné protizánětlivé vlastnosti (48). Zvýšené hladiny zvláště aktivní MMP-8 (aMMP-8), nikoli však latentní, neaktivní proformy, byly nalezeny v perorálních tekutinách postižených parodontitidou a periimplantitidou (sliny, ústní voda, gingivální štěrbinová tekutina (GCF) a periimplantační sulkulární tekutina (PISF)) (49). Klíčovou charakteristikou aktivních periodontálních a periimplantátových onemocnění je trvalá patologická elevace a aktivace aMMP-8 v periodontálních a periimplantátových tkáních, která se odráží v ústních tekutinách (50). V důsledku toho je aMMP-8 slibným kandidátem na biomarker pro diagnostiku a hodnocení progrese a průběhu těchto epizodických orálních zánětlivých tkáňových destruktivních a degenerativních onemocnění (46). Ještě důležitější je, že aMMP-8 v ústních tekutinách může také sloužit jako prediktivní a preventivní doplňkový biotechnologický nástroj k indikaci (49,50) preventivních intervencí (sekundární prevence nebo podpůrné periodontální/periimplantační terapii (51,52) ak inhibici nebo snížení přeměnu gingivitidy a mukositidy na periodontitidu a periimplantitidu, v daném pořadí.

Nedávno byly na základě dříve popsaných technologií a monoklonálních protilátek vyvinuty testy lateral-flow point-of-care (PoC)/chair-side testy (PerioSafe a ImplantSafe), objevené ve Finsku a dále vyvinuté v Německu (53), 54). Testy PerioSafe a ImplantSafe a čtečka (ORALyser) byly vyvinuty a vyrobeny společnostmi Medix Biochemica Ltd (Espoo, Finsko) a Dentognostics GmbH (Jena, Německo) a jsou komerčně dostupné od společnosti Dentognostics GmbH (Jena, Německo). Imunotesty PoC/chair-side aMMP-8 s laterálním průtokem ve skutečnosti připomínají klasické těhotenské a/nebo nedávno popsané testy HIV-PoC (55). Orální tekutinové testy aMMP-8 lze použít podle pokynů výrobce (47). PerioSafe měří a analyzuje hladiny aMMP-8 v ústní vodě a ImplantSafe v PISF a GCF; PerioSafe je tedy specifický pro pacienta a ImplantSafe je místně specifický (47,53). Testovací tyčinky PerioSafe a ImplantSafe lze kvantifikovat pomocí čtečky ORALyser za 5 minut PoC/strana křesla. PerioSafe a ImplantSafe s kvantifikací ORALyser jsou spolehlivé, kvantitativní, neinvazivní, bezpečné a levné doplňkové diagnostické nástroje v místě péče pro diagnostiku, screening, monitorování a prevenci onemocnění parodontu a periimplantátu (47). Pilotní případová-kontrolní studie periimplantitidy ukazuje 100% senzitivitu i specificitu pro test ImplantSafe [56].

Metodika a implementace:

K dosažení předchozích cílů byla navržena případová kontrolní studie, která bude probíhat na katedře parodontologie a biologie implantátů, Dental School, Aristotelova univerzita v Soluni.

Bude přijat studijní vzorek minimálně 100 pacientů navštěvujících Postgraduální kliniku parodontologie a biologie implantátů Stomatologické školy Aristotelovy univerzity v Soluni pro periodontální nebo periimplantační ošetření. Pacientům by měla být diagnostikována periimplantitida podle nejnovějších kritérií (2017)(4). Protokol studie bude předložen ke schválení Etické komisi Fakulty zubního lékařství Aristotelovy univerzity v Soluni a všichni pacienti budou požádáni, aby podepsali svůj informovaný souhlas.

- Pracovní balíčky: i. Polymorfismy genu COX-2: Od všech pacientů zařazených do studie bude odebrán bukální výtěr. Po extrakci DNA bude proveden proces polymerázové řetězové reakce (PCR) za účelem identifikace navržených polymorfismů za použití komerčních primerů specifických pro daný gen. Analýza genového polymorfismu a příslušný laboratorní proces budou provedeny ve spolupráci s Biologickou fakultou Přírodovědecké fakulty Aristotelovy univerzity v Soluni. Přesněji řečeno, vzorky budou odebrány od Ioannise Fragkioudakise (postgraduálního studenta katedry parodontologie a biologie implantátů, katedry zubního lékařství Aristotelovy univerzity v Soluni) a budou až do dalšího zpracování skladovány při -80 °C. Vzorky budou analyzovány ve spolupráci s katedrou biologie Aristotelovy univerzity v Soluni pod vedením profesora Minase Arsenakise. Proces bude provádět Ioannis Fragkioudakis a kandidátka na doktorandské studium Symela Koutounidou. Výběr tohoto spolupracujícího organismu vychází z předchozích zkušeností profesora Minase Arsenakise s analýzou genových polymorfismů a plně vybavené laboratoře umístěné na katedře biologie AUTh. Kromě toho PI prohlašuje úspěšnou předchozí spolupráci se členy vybrané organizace.

ii. Vzorky patogenní mikrobioty budou získány z vybraných implantátů vložením bodů sterilního endodontického papíru do každé periimplantační štěrbiny. Přesněji řečeno, vzorky budou odebrány od Ioannise Fragkioudakise (postgraduálního studenta Ústavu parodontologie a biologie implantátů, Ústav zubního lékařství Aristotelovy univerzity v Soluni) a budou skladovány při -80 °C až do dalšího zpracování. Vzorky budou analyzovány pomocí sekvenování nové generace (NGS). Přesněji řečeno, sekvenování 16S rRNA a HOMINGY budou použity k identifikaci celé mikrobioty obsažené ve vzorcích, což umožní charakterizaci všech taxonomických úrovní bakterií. NGS bude probíhat ve spolupráci s katedrou mikrobiologie Lékařské fakulty A.U.Th. Výběr spolupracujícího organismu a členů je založen na dostupnosti potřebného laboratorního vybavení (Přístup zajišťuje docentka Lemonia Skoura) v univerzitní všeobecné nemocnici AHEPA v Soluni. Potřebné laboratorní práce bude navíc provádět Fani Chatzopoulou (PhD student), obeznámený s procesy, pod dohledem docenta Dimitriose Chatzidimitriou.

iii. Analýza MMP-8 ImplantSafe rychlé aMMP8 analytické testy budou použity pro hodnocení hladin MMP-8 ve vybraných implantátech. Proces bude následující: Hladiny matricové metaloproteinázy (MMP)-8 (neutrofilní kolagenáza-2) v její aktivní formě (aMMP-8) budou sbírány z periimplantátové crevikulární tekutiny pomocí papírových proužků, které jsou součástí balení. test. Poté budou vzorky kvantitativně analyzovány digitální čtečkou ORALyzer® podle pokynů výrobce poskytujících okamžitou kvantifikaci hladin aMMP-8. Od roku 2019 je ORALyzer v majetku Kliniky parodontologie. Všechny vzorky odebere a analyzuje Ioannis Fragkioudakis.