Периимплантит и ММП-8

Зубные имплантаты стали неотъемлемой частью современной стоматологии в течение последних десятилетий. С тех пор, как была открыта остеоинтеграция (процесс внедрения имплантата в челюстную кость), имплантология со временем сделала значительный шаг вперед. Зубные имплантаты состоят из эндостальной части, изготовленной из титана, и внешней протезной части, что помогает в реабилитации пациентов с полной адентией. Они дают возможность пациентам, у которых отсутствует один или несколько зубов, добиться максимальных функциональных и эстетических результатов, воздерживаясь от довольно неприятных традиционных зубных протезов. Индустрия имплантатов постепенно развивается. В целом мировой рынок зубных имплантатов в 2016 году оценивался в 2,91 миллиарда долларов США, при этом в США ежегодно устанавливается более 8,809 миллиона имплантатов (1). Тем не менее, распространенность биологических осложнений, связанных с реставрациями с опорой на дентальные имплантаты, растет с той же скоростью (1).

Термин «периимплантит» был введен на 1-м Европейском семинаре по пародонтологии в 1994 г., и с тех пор было предложено множество определений для описания потери костной массы, которая характеризует последствия установки имплантата (2,3). Периимплантит и периимплантатный мукозит охватываются термином периимплантатные заболевания и считаются аналогичными заболеваниям пародонта (4). В настоящее время периимплантит определяется как патологическое состояние вокруг зубных имплантатов, характеризующееся воспалением слизистой оболочки вокруг имплантата и прогрессирующей потерей костной ткани, что в конечном итоге ставит под угрозу судьбу имплантата (5). По данным PubMed, количество исследований, посвященных периимплантиту, возросло за последние 30 лет с 86 статей в 90-х годах до 1938 рукописей до настоящего времени (1). Распространенность периимплантита также имеет тенденцию к росту. В систематическом обзоре Zitzman и Berglundh в 2008 г. сообщалось о распространенности от 12 до 56% (3). Более поздние исследования показывают распространенность 22% (1-47%) (6), 20% (7), 26% (8) и 28% (9). Следует отметить, что в предыдущих исследованиях точную распространенность заболевания трудно оценить, и она зависит от нескольких факторов, включая диагностические критерии заболевания и момент времени, выбранный для оценки (10). Тем не менее, очевидно, что периимплантит является растущей проблемой, влияющей на имплантологию, и, безусловно, станет темой многих будущих исследований.

Для лечения периимплантита было предложено несколько протоколов, включая нехирургические протоколы с использованием устройств для обеззараживания имплантатов и лазеров, а также хирургические протоколы, такие как использование регенеративных материалов (11,12). Однако, если периимплантит уже установлен, предложенные стратегии и рекомендации по его лечению все же можно считать эмпирическими. Судя по имеющимся данным, нехирургическая терапия неэффективна, по крайней мере, в запущенных случаях. Хирургические методы могут быть необходимы для обеспечения адекватного доступа для эффективной дегрануляции воспаленных тканей, а также для обеззараживания поверхности имплантата (13).

В консенсусном отчете Рабочей группы 4 Всемирного семинара по классификации пародонтальных и периимплантационных заболеваний и состояний 2017 г. сделан вывод о том, что периимплантит представляет собой воспалительный процесс микробного происхождения, вызывающий потерю костной массы (4). Кроме того, несколько факторов риска были предложены в качестве потенциальных сопутствующих факторов при этом заболевании, включая пародонтит в анамнезе, курение, диабет и плохой контроль зубного налета (5). Такие факторы, как генетическая предрасположенность и высвобождение частиц титана, также были указаны как потенциальные факторы риска (14). Было установлено микробное участие в инициации и прогрессировании периимплантита, однако недавние исследования показывают, что периимплантит может быть результатом реакции на инородное тело, подчеркивая роль реакции хозяина в инициировании заболевания. (15). Другими словами, этиология заболевания до сих пор не выяснена. Однако с помощью обычного ДНК-зонда и культурального анализа общие пародонтопатогенные бактерии были выделены как в здоровых, так и в пораженных участках имплантата (16), и распределение обнаруженных видов заметно не различалось в зависимости от клинического состояния имплантата (17). Однако по сравнению со здоровыми участками имплантата периимплантит был связан с более высоким количеством видов бактерий, считающихся консенсусными пародонтальными патогенами, включая Porphyromonas gingivalis и Tannerella forsythia (18). Более того, наблюдательные исследования показали, что периимплантит чаще был связан с условно-патогенными микроорганизмами, такими как Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, (19,20) грибковыми организмами (например, Candida albicans, Candida boidinii, Penicillum spp., Rhadotorula laryngis, Paelicomyces spp.) (21,22) и вирусы (т.е. цитомегаловирус человека, вирус Эпштейна-Барра) (23), что указывает на довольно сложную и гетерогенную инфекцию. Таким образом, определение точного бактериального состава периимплантатных поражений имеет первостепенное значение.

Важным наблюдением относительно отказов имплантатов является то, что обычно небольшое количество пациентов теряет много имплантатов. Это явление кластеризации было выявлено во многих исследованиях (24,25). Weyant и его коллеги изучили выживаемость имплантатов у 598 пациентов и заметили, что более чем в половине случаев, когда было установлено несколько имплантатов, произошел более чем один отказ. Они подсчитали, что пациенты, у которых был потерян один имплантат, в 1,3 раза чаще теряли больше имплантатов (26). Эти результаты привели к гипотезе о том, что факторы хозяина влияют на выживаемость имплантата, и поэтому генетическая предрасположенность может играть важную роль в развитии периимплантита. Были оценены многие полиморфизмы генов. Первоначально большинство исследований касалось полиморфизмов цитокинов, играющих ключевую роль в иммунном ответе (27–29), таких как интерлейкины IL-1α, IL-1β и их белки-антагонисты IL-1ra, IL-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ФНО-α и трансформирующий фактор роста-β1 (TGF-β1). Помимо них, были исследованы различные другие гены, например. гены, кодирующие CD14, рецептор-активатор лиганда ядерного фактора каппа-В (RANKL), микроРНК, костные морфогенетические белки (BMP), фактор роста фибробластов (FGF), ассоциированный с членом семейства TRAF активатор NF-каппа-β (TANK), серин/треонин -протеинкиназа B-Raf (BRAF), рецептор кальцитонина (CTR), гаптоглобин. В результатах вышеупомянутых исследований имеется много расхождений. Некоторым удалось обнаружить возможные ассоциации, а другим нет. Более новым полиморфизмом гена, упомянутым в генетических исследованиях, является полиморфизм циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2). Было показано, что однонуклеотидный полиморфизм ЦОГ-2 изменяет экспрессию гена ЦОГ-2. В нескольких исследованиях была обнаружена связь между полиморфизмом гена ЦОГ-2 и периодонтитом (30-32). Однако в случае периимплантита данных мало.

Диагноз периимплантита основывается на традиционных клинических показателях, аналогичных оценке заболеваний пародонта. В частности, диагноз устанавливается по наличию кровотечения и/или нагноения при осторожном зондировании, увеличению глубины зондирования по сравнению с предыдущими клиническими обследованиями и наличию потери костной массы за пределами изменения уровня крестальной кости в результате начального ремоделирования кости (4). Однако недавние исследования ставят под сомнение диагностическую точность клинических показателей как таковых, подтверждая, что диагностика заболевания гораздо сложнее (33). В связи с этим были использованы новые диагностические методы для ранней и правильной диагностики заболевания (34). Биомаркер или биологический маркер — это измеримый индикатор некоторого биологического состояния или состояния. Биомаркеры часто измеряют и оценивают для изучения нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство, и они полезны в диагностике и прогнозировании заболевания. В случае периимплантита несколько биологических молекул были оценены как потенциальные биомаркеры, помогающие диагностировать заболевание. Такие молекулы, как TNF-a, IL-1, RANKL, были связаны с периимплантитом в различных исследованиях (34). В последнее время матриксная металлопротеиназа 8 (ММР-8), особенно в ее активной форме (аММР-8), привлекла большое внимание как многообещающий кандидат в биомаркеры для диагностики и оценки прогрессирования и течения этих эпизодических воспалительных деструктивных и дегенеративных заболеваний тканей полости рта. 35,36).

В совокупности периимплантит представляет собой сложное заболевание с высокой распространенностью среди населения. Кроме того, современные данные об этиологии и диагностике заболевания противоречивы.

ЦЕЛИ ПРЕДЛОЖЕНИЯ, СОСТОЯНИЕ И ПРОБЛЕМЫ

1. Изучить взаимосвязь периимплантита с полиморфизмом гена ЦОГ-2, поскольку в литературе нет подобных исследований.
2. Идентифицировать патогенную микробиоту, связанную с заболеванием, с помощью новых методов идентификации бактерий.
3. Оценить диагностическую точность теста на аММР-8 в присутствии пациента при периимплантите.

Обоснование изучения каждой из изучаемых задач будет проанализировано в отдельном разделе.

- полиморфизмы гена ЦОГ-2. Генетическая предрасположенность считается потенциальным фактором риска периимплантита, как уже упоминалось. Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) представляет собой однонуклеотидную вариацию в определенном положении генома. Каждая вариация проявляется в некоторой заметной степени в популяции. SNP могут встречаться в кодирующих и некодирующих последовательностях генов или в межгенных областях. Учитывая вырожденность генетического кода, SNP внутри кодирующей последовательности могут изменять аминокислотную последовательность кодирующего полипептида (несинонимичные SNP) или не влиять на последовательность белка (синонимичные SNP). SNP за пределами областей, кодирующих белок, могут по-прежнему регулировать экспрессию генов, влияя на связывание фактора транскрипции, сплайсинг генов, деградацию мРНК или последовательность некодирующей РНК. Следовательно, SNP лежат в основе различий в нашей восприимчивости к болезням. SNP генов воспалительных цитокинов могут влиять на уровни их экспрессии или аминокислотную последовательность и, следовательно, на воспалительную реакцию хозяина.

ЦОГ-2 превращает арахидоновую кислоту в простагландин Н2, который является предшественником простагландина Е2. Простагландин Е2, который опосредует провоспалительные и противовоспалительные реакции во многих тканях (37), также частично отвечает за процессы активации, участвующие в резорбции альвеолярной кости в патогенезе пародонтита. Ассоциации гена циклооксигеназы 2 (СОХ-2) с периодонтитом были впервые выявлены в тайваньской и китайской популяциях случай-контроль (30,31) и впоследствии подтверждены в популяции северо-западной Европы. Исследования как таковые с участием гена ЦОГ-2 в случае периимплантита еще не проводились. Однако недавно изученная экспрессия генов выявила повышенную активность пути ЦОГ-2 в случае периимплантита (38, 39), что указывает на то, что ЦОГ-2 может играть важную роль в патогенезе периимплантита. Связь периимплантита с определенным полиморфизмом генов позволит лучше понять заболевание, что приведет к более эффективным стратегиям профилактики и лечения.

• Микробные факторы, связанные с периимплантитом Текущие данные подтверждают, что в периимплантатных инфекциях преобладают грамотрицательные бактерии, как и в пародонтальных инфекциях, но в некоторых случаях может присутствовать особая микробиота (20,40,41). Хотя ранние отчеты показали сходство между периимплантатной и пародонтальной флорой, более поздние исследования показали, что периимплантитные поражения могут представлять не только консенсусные пародонтальные патогены, но и условно-патогенные микроорганизмы, такие как S.aureus, S.anaerobius, Escherichia coli, Candida и Streptococci. вид (18). Кроме того, методы секвенирования также выявили другие некультивируемые микроорганизмы, связанные с периимплантатным заболеванием. Были идентифицированы асахаролитические анаэробные грамположительные палочки (AAGPR), такие как Eubacterium nodatum, Eubacterium brachy, Slackia exigua, Gemella sanguinis, и анаэробные грамотрицательные палочки (OGNR), такие как Mitsuokella sp., Treponema lecithinolyticum (42). Расхождения между этими исследованиями могут возникать из-за различных методов, используемых для микробиологического отбора проб и их обработки (43). Микробиологический профиль заболеваний вокруг имплантатов остается предметом интереса, и было проведено множество исследований и обзоров, чтобы сделать вывод, отличается ли микробиота от микробиоты пародонтита; однако споры все еще существуют. В последних исследованиях сделан вывод о том, что нет достаточных доказательств, подтверждающих различную микробиоту между периимплантатными заболеваниями и заболеваниями пародонта (44,45), в то время как в других утверждается, что они могут быть разными объектами с точки зрения микробиологического профиля (43). Поэтому необходимо провести дальнейшие исследования, чтобы определить микробиологический профиль тканей вокруг имплантата. Новейшие технологии, такие как дробовое секвенирование всего генома бактерий, вовлеченных в периимплантит, были бы очень полезны для этой цели, но до сих пор такие исследования не были опубликованы. Таким образом, в этом исследовании будет использоваться секвенирование нового поколения для выявления наиболее гнойной микробиоты, связанной с заболеванием. Секвенирование 16s рРНК позволит охарактеризовать всю таксономическую идентичность поражений вокруг имплантатов.
• Диагностическая точность теста биомаркеров ImplantSafe MMP-8. Нейтрофильная коллагеназа, также называемая матриксной металлопротеиназой (ММР)-8, полиморфноядерной (PMN) лейкоцитарной коллагеназой или коллагеназой-2, была идентифицирована и охарактеризована как основной коллагенолитический фермент, вызывающий активную пародонтальную и периимплантатную дегенерацию (APD) при пародонтите и периимплантит (46,47). MMP-8 может разрешать и регулировать воспалительные и иммунологические каскады путем процессинга нематричных биоактивных субстратов, таких как хемокины, цитокины, серпины и компоненты комплемента. Физиологические уровни MMP-8 могут проявлять защитные и защитные противовоспалительные свойства (48). Повышенные уровни особенно активной ММП-8 (аММП-8), но не латентной, неактивной проформы, были обнаружены в ротовой жидкости, пораженной пародонтитом и периимплантитом (слюна, жидкость для полоскания рта, жидкость десневой борозды (GCF) и околоимплантатная бороздчатая жидкость (PISF)) (49). Ключевой характеристикой активных заболеваний пародонта и периимплантата является устойчивое патологическое повышение и активация аММП-8 в тканях пародонта и периимплантата, что отражается в ротовой жидкости (50). Следовательно, аММР-8 является многообещающим биомаркером для диагностики и оценки прогрессирования и течения этих эпизодических воспалительных деструктивных и дегенеративных заболеваний тканей полости рта (46). Что еще более важно, аММР-8 в ротовой жидкости может также служить прогностическим и профилактическим дополнительным биотехнологическим инструментом для указания (49, 50) профилактических вмешательств (вторичная профилактика или поддерживающая пародонтальная/периимплантационная терапия (51, 52) и для подавления или уменьшения превращение гингивита и мукозита в пародонтит и периимплантит соответственно.

Недавно на основе ранее описанных технологий и моноклональных антител (53, 54). Тесты PerioSafe и ImplantSafe, а также ридер (ORALyser) были разработаны и изготовлены компаниями Medix Biochemica Ltd (Эспоо, Финляндия) и Dentognostics GmbH (Йена, Германия) и коммерчески доступны от Dentognostics GmbH (Йена, Германия). Фактически, иммунологические тесты PoC/бокового потока аММР-8 в кресле напоминают классические тесты на беременность и/или недавно описанные тесты PoC на ВИЧ-инфекцию (55). Тесты ротовой жидкости на ММР-8 можно использовать в соответствии с инструкциями производителя (47). PerioSafe измеряет и анализирует уровни аММР-8 в ополаскивателях для рта и ImplantSafe в PISF и GCF; таким образом, PerioSafe зависит от пациента, а ImplantSafe — от места установки (47, 53). Тест-полоски PerioSafe и ImplantSafe можно количественно определить с помощью считывающего устройства ORALyser за 5 минут PoC/со стороны кресла. PerioSafe и ImplantSafe с количественным анализом ORALyser являются надежными, количественными, неинвазивными, безопасными и недорогими дополнительными диагностическими инструментами для диагностики, скрининга, мониторинга и профилактики заболеваний пародонта и периимплантатных заболеваний (47). Пилотное исследование периимплантита методом случай-контроль показало 100% чувствительность и специфичность теста ImplantSafe (56).

Методология и реализация:

Для достижения предыдущих целей было разработано исследование «случай-контроль», которое будет проводиться на кафедре пародонтологии и биологии имплантатов стоматологической школы Университета Аристотеля в Салониках.

Будет отобрана выборка из минимум 100 пациентов, посещающих Клинику последипломного образования пародонтологии и биологии имплантатов Стоматологической школы Университета Аристотеля в Салониках для лечения пародонта или периимплантатного лечения. Пациентам следует диагностировать периимплантит в соответствии с последними (2017 г.) (4) критериями. Протокол исследования будет подан на одобрение в Комитет по этике стоматологического факультета Университета Аристотеля в Салониках, и всем пациентам будет предложено подписать свое информированное согласие.

- Рабочие пакеты: i. Полиморфизмы гена COX-2: у всех пациентов, включенных в исследование, будет взят буккальный мазок. После выделения ДНК будет проведен процесс полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации предполагаемых полиморфизмов с использованием коммерческих праймеров, специфичных для гена. Анализ полиморфизма генов и соответствующий лабораторный процесс будут проводиться в сотрудничестве со школой биологии факультета естественных наук Университета Аристотеля в Салониках. В частности, образцы будут взяты у Иоанниса Фрагкиудакиса (аспиранта кафедры пародонтологии и биологии имплантатов кафедры стоматологии Университета Аристотеля в Салониках) и будут храниться при температуре -80°C до дальнейшей обработки. Образцы будут проанализированы в сотрудничестве с кафедрой биологии Университета Аристотеля в Салониках под руководством профессора Минаса Арсенакиса. Процесс будет осуществляться Иоаннисом Фрагкиудакисом и докторантом Симелой Кутуниду. Выбор этого сотрудничающего организма основан на предыдущем опыте профессора Минаса Арсенакиса в анализе полиморфизмов генов и полностью оборудованной лаборатории, расположенной в отделении биологии AUTh. Кроме того, PI заявляет об успешном предыдущем сотрудничестве с членами выбранной организации.

II. Образцы патогенной микробиоты будут получены из выбранных имплантатов путем введения стерильных бумажных эндодонтических штифтов в каждую щель вокруг имплантата. В частности, образцы будут взяты у Иоанниса Фрагкиудакиса (аспирант кафедры пародонтологии и биологии имплантатов кафедры стоматологии Университета Аристотеля в Салониках) и будут храниться при температуре -80°C до дальнейшей обработки. Образцы будут проанализированы с использованием Секвенирование следующего поколения (NGS). В частности, секвенирование 16S рРНК и HOMINGS будут использоваться для идентификации всей микробиоты, включенной в образцы, что позволит охарактеризовать все таксономические уровни бактерий. NGS будет проводиться в сотрудничестве с кафедрой микробиологии Медицинской школы AUTh. Выбор сотрудничающей организации и членов основывается на наличии необходимого лабораторного оборудования (доступ предоставляется ассоциированным профессором Лемонией Скура) в больнице общего профиля университета AHEPA в Салониках. Кроме того, необходимые лабораторные работы будут проводиться Фани Чацопулу (аспирант), знакомой с процессами, под руководством доцента Димитриоса Хацидимитриу.

III. Анализ MMP-8 Для оценки уровней MMP-8 в выбранных имплантатах будут использоваться экспресс-тесты ImplantSafe для экспресс-анализа aMMP8. Процесс будет следующим: Уровни матриксной металлопротеиназы (ММП)-8 (коллагеназы нейтрофилов-2) в ее активной форме (аММП-8) будут собираться из периимплантатной щелевой жидкости с помощью бумажных полосок, включенных в тест. После этого образцы будут количественно проанализированы с помощью цифрового считывающего устройства ORALyzer® в соответствии с инструкциями производителя, дающими мгновенную количественную оценку уровней аММП-8. ORALyzer находится в распоряжении отделения пародонтологии с 2019 года. Все образцы будут собраны и проанализированы Иоаннисом Фрагкиудакисом.