Perimplantite e MMP-8

Gli impianti dentali sono diventati parte integrante dell'odontoiatria moderna negli ultimi decenni. Da quando è stata scoperta l'osteointegrazione (il processo di incorporazione di un impianto nell'osso mascellare), l'odontoiatria implantare ha compiuto passi sostanziali nel tempo. Gli impianti dentali sono costituiti da una parte endossea in titanio e da una parte protesica esterna, che aiutano nella riabilitazione dei pazienti edentuli. Offrono la possibilità ai pazienti a cui mancano uno o più denti di ottenere i massimi risultati funzionali ed estetici, evitando le protesi tradizionali che sono piuttosto sgradevoli. L'industria degli impianti sta gradualmente crescendo. Complessivamente, il mercato globale degli impianti dentali è stato valutato a 2,91 miliardi di dollari nel 2016 con oltre 8,809 milioni di impianti inseriti ogni anno negli Stati Uniti (1). Tuttavia, la prevalenza di complicanze biologiche relative ai restauri supportati da impianti dentali sta crescendo allo stesso ritmo (1).

Il termine "Perimplantite" è stato introdotto nel 1° Workshop Europeo di Parodontologia nel 1994 e da allora sono state proposte numerose definizioni per descrivere la perdita ossea che caratterizza le conseguenze dell'installazione dell'impianto (2,3). La perimplantite e la mucosite perimplantare sono coperte dal termine malattie perimplantari e sono considerate analoghe alle malattie parodontali (4). Attualmente, la perimplantite è definita come la condizione patologica attorno agli impianti dentali caratterizzata da infiammazione della mucosa perimplantare e progressiva perdita ossea, fino a compromettere il destino dell'impianto (5). Il numero di studi riferiti alla perimplantite è aumentato negli ultimi 30 anni secondo PubMed, da 86 articoli negli anni '90 a un totale di 1938 manoscritti fino ad oggi (1). Anche la prevalenza della perimplantite mostra tassi di crescita. In una revisione sistematica, Zitzman e Berglundh nel 2008 hanno riportato una prevalenza compresa tra il 12 e il 56% (3). Studi più recenti rivelano una prevalenza del 22% (1-47%) (6), 20% (7), 26% (8) e 28% (9). Va sottolineato che negli studi precedenti l'esatta prevalenza della malattia è difficile da stimare e dipende da diversi fattori tra cui i criteri diagnostici della malattia e il punto temporale scelto per la valutazione (10). Tuttavia, è ovvio che la perimplantite è un problema crescente che affligge l'implantologia e sarà sicuramente oggetto di molti studi futuri.

Sono stati proposti diversi protocolli per il trattamento della perimplantite, inclusi protocolli non chirurgici, con dispositivi di decontaminazione dell'impianto e laser e protocolli chirurgici come l'uso di materiali rigenerativi (11,12). Tuttavia, se la perimplantite è già accertata, le strategie e le raccomandazioni proposte per il suo trattamento possono ancora essere considerate empiriche. Dalle evidenze esistenti sembra che la terapia non chirurgica non sia efficace, almeno non nei casi avanzati. Le tecniche chirurgiche possono essere necessarie per fornirci un accesso adeguato per degranulare efficacemente i tessuti infiammati e per decontaminare la superficie dell'impianto (13).

Il rapporto di consenso del gruppo di lavoro 4 del workshop mondiale 2017 sulla classificazione delle malattie e condizioni parodontali e perimplantari ha concluso che la perimplantite è un processo infiammatorio di origine microbica che causa la perdita ossea (4). Inoltre, diversi fattori di rischio sono stati proposti come potenziali co-driver di questa entità, tra cui anamnesi di parodontite, fumo, diabete e scarso controllo della placca (5). Anche fattori come la predisposizione genetica e il rilascio di particelle di titanio sono stati indicati come potenziali fattori di rischio (14). Il coinvolgimento microbico nell'inizio e nella progressione della perimplantite è stato stabilito, tuttavia studi recenti suggeriscono che la perimplantite può essere il risultato di una reazione da corpo estraneo, sottolineando il ruolo della risposta dell'ospite nell'inizio della malattia. (15). In altre parole, l'eziologia della malattia deve ancora essere chiarita. Tuttavia, utilizzando la sonda del DNA convenzionale e le analisi colturali, i comuni batteri parodontopatogeni sono stati isolati nei siti implantari sani e malati (16) e la distribuzione delle specie rilevate non differiva in modo marcato dallo stato clinico dell'impianto (17). Tuttavia, se confrontata con i soli siti implantari sani, la perimplantite era associata a conteggi più elevati di specie batteriche considerate patogeni parodontali di consenso, tra cui Porphyromonas gingivalis e Tannerella forsythia (18). Inoltre, studi osservazionali hanno indicato che la perimplantite era più frequentemente collegata a patogeni opportunisti come Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, (19,20) organismi fungini (ad es. Candida albicans, Candida boidinii, Penicillum spp., Rhadotorula laryngis, Paelicomyces spp.),(21,22) e virus (es. citomegalovirus umano, virus di Epstein-Barr), (23) indicando così un'infezione piuttosto complessa ed eterogenea. Pertanto, il riconoscimento dell'esatta composizione batterica delle lesioni perimplantari è di fondamentale importanza.

Un'osservazione significativa sui fallimenti implantari è che di solito un piccolo numero di pazienti perde molti impianti. Questo fenomeno di clusterizzazione è stato identificato in molti studi (24,25). Weyant ei suoi colleghi hanno esaminato il tasso di sopravvivenza degli impianti in 598 pazienti e hanno notato che più della metà dei casi che hanno ricevuto più impianti hanno avuto più di un fallimento. Hanno stimato che i pazienti che avevano perso un impianto avevano 1,3 probabilità in più di perdere più impianti (26). Questi risultati hanno portato all'ipotesi che i fattori dell'ospite influenzano la sopravvivenza dell'impianto e quindi la predisposizione genetica può svolgere un ruolo importante nello sviluppo della perimplantite. Sono stati valutati molti polimorfismi genici. Inizialmente, la maggior parte degli studi si riferiva a polimorfismi di citochine che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria (27-29), come le interleuchine IL-1α, IL-1β e la loro proteina antagonista IL-1ra, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α e fattore di crescita trasformante-β1 (TGF-β1). Oltre a questi, sono stati studiati vari altri geni, ad es. geni che codificano CD14, attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare kappa B (RANKL), microRNA, proteine ​​morfogenetiche ossee (BMP), fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), attivatore NF-kappa-β associato ai membri della famiglia TRAF (TANK), serina/treonina -proteina chinasi B-Raf (BRAF), recettore della calcitonina (CTR), aptoglobina. Ci sono molte discrepanze nei risultati degli studi sopra menzionati. Alcuni sono riusciti a rilevare possibili associazioni e altri no. Un polimorfismo genico più nuovo menzionato negli studi genetici è quello della cicloossigenasi-2 (COX-2). È stato dimostrato che un polimorfismo a singolo nucleotide di COX-2 altera l'espressione del gene COX-2. Diversi studi hanno trovato un'associazione tra i polimorfismi del gene COX-2 e la parodontite (30-32). Tuttavia, nel caso della perimplantite i dati sono scarsi.

La diagnosi di perimplantite si basa su indici clinici tradizionali, simili alla valutazione della malattia parodontale. In particolare, la diagnosi è stabilita dalla presenza di sanguinamento e/o suppurazione al sondaggio delicato, maggiore profondità di sondaggio rispetto ai precedenti esami clinici e presenza di perdita ossea oltre i cambiamenti del livello osseo crestale derivanti dal rimodellamento osseo iniziale (4). Tuttavia, studi recenti mettono in discussione l'accuratezza diagnostica degli indici clinici in quanto tali, sostenendo che la diagnosi della malattia è molto più complessa (33). A questo proposito, sono stati utilizzati nuovi metodi diagnostici per ottenere una diagnosi precoce e corretta della malattia (34). Un biomarcatore, o marcatore biologico, è un indicatore misurabile di alcuni stati o condizioni biologiche. I biomarcatori sono spesso misurati e valutati per esaminare i normali processi biologici, i processi patogenetici o le risposte farmacologiche a un intervento terapeutico e sono utili nella diagnosi e nella prognosi di una malattia. Nel caso della perimplantite diverse molecole biologiche sono state valutate come potenziali biomarcatori utili alla diagnosi della malattia. Molecole come TNF-a, IL-1, RANKL sono state associate alla perimplantite in una varietà di studi (34). Ultimamente, la metalloproteinasi 8 della matrice, (MMP-8), specialmente nella sua forma attiva (aMMP-8) ha guadagnato molta attenzione diventando un promettente biomarcatore candidato per la diagnosi e la valutazione della progressione e del decorso di queste episodiche malattie distruttive e degenerative del tessuto infiammatorio orale ( 35,36).

Nel complesso, la perimplantite è una malattia complicata con un'elevata prevalenza tra la popolazione. Inoltre, i dati attuali sull'eziologia e sulla diagnosi della malattia sono controversi.

OBIETTIVI DELLA PROPOSTA, STATO DELL'ARTE E SFIDE

1. Affrontare la relazione della perimplantite con i polimorfismi del gene COX-2, in quanto non esistono studi simili in letteratura.
2. Identificare il microbiota patogeno associato alla malattia utilizzando nuovi metodi di identificazione batterica.
3. Per valutare l'accuratezza diagnostica di un test alla poltrona aMMP-8 Point-of-care nella perimplantite.

La logica nello studio di ciascuno degli obiettivi studiati sarà analizzata in una sezione separata.

- Polimorfismi del gene COX-2. La predisposizione genetica è considerata un potenziale fattore di rischio per la perimplantite come già accennato. Un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) è una variazione a singolo nucleotide in una posizione specifica del genoma. Ogni variazione appare in una certa misura apprezzabile all'interno di una popolazione. Gli SNP possono verificarsi all'interno di sequenze di geni codificanti e non codificanti o nelle regioni intergeniche. Considerando la degenerazione del codice genetico, l'SNP all'interno di una sequenza codificante può modificare la sequenza amminoacidica del polipeptide codificante (SNP non sinonimo) o non influenzare la sequenza proteica (SNP sinonimo). Gli SNP al di fuori delle regioni codificanti proteine ​​possono ancora regolare l'espressione genica influenzando il legame del fattore di trascrizione, lo splicing genico, la degradazione dell'mRNA o la sequenza dell'RNA non codificante. Pertanto, gli SNP sono alla base delle differenze nella nostra suscettibilità alle malattie. Gli SNP dei geni delle citochine infiammatorie possono influenzare i loro livelli di espressione o la sequenza degli amminoacidi e, di conseguenza, la risposta infiammatoria dell'ospite.

COX-2 converte l'acido arachidonico in prostaglandina H2, che è il precursore della prostaglandina E2. La prostaglandina E2, che media le reazioni proinfiammatorie e antinfiammatorie in molti tessuti (37), è anche in parte responsabile dei processi di attivazione coinvolti nel riassorbimento dell'osso alveolare durante la patogenesi della parodontite. Le associazioni del gene della cicloossigenasi 2 (COX-2) con la parodontite sono state identificate per la prima volta in popolazioni caso-controllo taiwanesi e cinesi (30,31) e successivamente convalidate in una popolazione dell'Europa nord-occidentale. Gli studi in quanto tali che coinvolgono il gene COX-2 non sono ancora stati condotti nel caso della perimplantite. Tuttavia, l'espressione genica recentemente studiata ha rivelato un aumento dell'attività della via COX-2 nel caso della perimplantite (38,39), il che implica che la COX-2 può svolgere un ruolo importante nella patogenesi della perimplantite. L'associazione della perimplantite con alcuni polimorfismi genici consentirà una migliore comprensione della malattia, portando a strategie di prevenzione e trattamento più efficaci.

• Fattori microbici associati alla perimplantite I dati attuali confermano che le infezioni perimplantari sono dominate da batteri Gram negativi, simili alle infezioni parodontali, ma alcuni casi possono ospitare un microbiota distinto (20,40,41). Sebbene i primi rapporti mostrassero somiglianze tra la flora perimplantare e parodontale, studi successivi hanno dimostrato che le lesioni perimplantari possono presentare non solo patogeni parodontali di consenso, ma anche microrganismi opportunisti, come S.aureus, S. anaerobius, Escherichia coli, Candida e streptococchi spp (18). Inoltre, i metodi di sequenziamento hanno rivelato anche altri microrganismi non coltivabili associati alla malattia perimplantare. Sono stati identificati bastoncini Gram-positivi anaerobici asaccarolitici (AAGPR) come Eubacterium nodatum, Eubacterium brachy, Slackia exigua, Gemella sanguinis e bastoncini Gram-negativi anaerobici (OGNR) come Mitsuokella sp., Treponema lecithinolyticum (42). Le discrepanze tra questi studi possono derivare dai diversi metodi utilizzati per il campionamento e l'elaborazione microbiologici (43). Il profilo microbiologico delle malattie perimplantari rimane una questione di interesse e sono state condotte molte indagini e revisioni per concludere se il microbiota è diverso da quello della parodontite; tuttavia, esistono ancora controversie. L'ultimo degli studi conclude che non ci sono prove sufficienti per supportare il microbiota distinto tra malattie perimplantari e parodontali (44,45) mentre altri affermano che potrebbero essere entità diverse in termini di profilo microbiologico (43). Pertanto, è necessario condurre ulteriori studi per definire il profilo microbiologico dei tessuti perimplantari. Le più recenti tecnologie, come il sequenziamento shotgun dell'intero genoma dei batteri coinvolti nella perimplantite, sarebbero molto utili a questo scopo, ma finora nessuna ricerca di questo tipo è stata pubblicata. Pertanto, in questo studio verrà utilizzato il sequenziamento di nuova generazione per identificare il microbiota più purulento associato alla malattia. Il sequenziamento dell'rRNA 16s consentirà la caratterizzazione dell'intera identità tassonomica delle lesioni perimplantari.
• Precisione diagnostica del test dei biomarcatori ImplantSafe MMP-8. La collagenasi neutrofila, chiamata anche metalloproteinasi della matrice (MMP)-8, collagenasi leucocitaria polimorfonucleare (PMN) o collagenasi-2, è stata identificata e caratterizzata come un importante enzima collagenolitico che causa la degenerazione attiva parodontale e perimplantare (APD) nella parodontite e perimplantite (46,47). MMP-8 può risolvere e regolare cascate infiammatorie e immunologiche elaborando substrati bioattivi non di matrice come chemochine, citochine, serpine e componenti del complemento. I livelli fisiologici di MMP-8 possono esercitare caratteristiche antinfiammatorie protettive e difensive (48). Nei fluidi orali affetti da parodontite e perimplantite (saliva, collutorio, liquido crevicolare gengivale (GCF)) sono stati riscontrati livelli aumentati di MMP-8 particolarmente attiva (aMMP-8), ma non la proforma latente e inattiva. fluido sulculare perimplantare (PISF)) (49). Una caratteristica chiave delle malattie parodontali e perimplantari attive è l'elevazione patologica sostenuta e l'attivazione di aMMP-8 nei tessuti parodontali e perimplantari, che si riflettono nei fluidi orali (50). Di conseguenza, aMMP-8 è un promettente biomarcatore candidato per la diagnosi e la valutazione della progressione e del decorso di queste malattie distruttive e degenerative del tessuto infiammatorio orale episodico (46). Ancora più importante, l'aMMP-8 nei fluidi orali può anche servire come strumento biotecnologico aggiuntivo predittivo e preventivo per indicare (49,50) interventi preventivi (prevenzione secondaria o terapia parodontale/peri-implantare di supporto (51,52) e per inibire o ridurre la conversione della gengivite e della mucosite rispettivamente in parodontite e perimplantite.

Recentemente, i test a flusso laterale point-of-care (PoC)/chair-side (PerioSafe e ImplantSafe), scoperti in Finlandia e ulteriormente sviluppati in Germania (53), sono stati sviluppati sulla base di tecnologie precedentemente descritte e di anticorpi monoclonali (53, 54). I test, PerioSafe e ImplantSafe, e il lettore (ORAlyser) sono stati sviluppati e prodotti da Medix Biochemica Ltd (Espoo, Finlandia) e Dentognostics GmbH (Jena, Germania) e sono disponibili in commercio da Dentognostics GmbH (Jena, Germania). Infatti, gli immunotest aMMP-8 a flusso laterale PoC/chair-side assomigliano ai classici test di gravidanza e/o HIV-PoC descritti di recente (55). I test del fluido orale aMMP-8 possono essere utilizzati secondo le istruzioni del produttore (47). PerioSafe misura e analizza i livelli di aMMP-8 nel collutorio e ImplantSafe in PISF e GCF; pertanto, PerioSafe è specifico per il paziente e ImplantSafe è specifico per il sito (47,53). Gli stick di test PerioSafe e ImplantSafe possono essere quantificati dal lettore ORALyser in 5 min PoC/alla poltrona. PerioSafe e ImplantSafe con quantificazione ORALyser sono strumenti diagnostici aggiuntivi affidabili, quantitativi, non invasivi, sicuri ed economici per la diagnosi, lo screening, il monitoraggio e la prevenzione delle malattie parodontali e perimplantari (47). Uno studio pilota caso-controllo sulla perimplantite mostra sia una sensibilità che una specificità del 100% per il test ImplantSafe (56).

Metodologia e implementazione:

Per raggiungere gli obiettivi precedenti è stato progettato uno studio caso controllo che sarà condotto presso il dipartimento di parodontologia e biologia implantare, Dental School, Università Aristotele di Salonicco.

Verrà reclutato un campione di studio di almeno 100 pazienti che frequentano la Clinica post-laurea di parodontologia e biologia implantare della Dental School Aristotle University of Thessaloniki per il trattamento parodontale o perimplantare. Ai pazienti dovrebbe essere diagnosticata una perimplantite secondo i criteri più recenti (2017)(4). Il protocollo di studio sarà applicato al Comitato Etico della Facoltà di Odontoiatria dell'Università Aristotele di Salonicco per l'approvazione e a tutti i pazienti verrà chiesto di firmare il proprio consenso informato.

- Pacchetti di lavoro: i. Polimorfismi del gene COX-2: Il tampone buccale sarà ottenuto da tutti i pazienti inclusi nello studio. Dopo l'estrazione del DNA, verrà eseguito un processo di reazione a catena della polimerasi (PCR) per identificare i polimorfismi proposti, utilizzando primer commerciali specifici per il gene. Le analisi del polimorfismo genico e il relativo processo di laboratorio saranno effettuati con la collaborazione della scuola di Biologia, Facoltà di Scienze, Università Aristotele di Salonicco. Più specificamente, i campioni saranno prelevati da Ioannis Fragkioudakis (studente post-laurea del Dipartimento di Parodontologia e Biologia Implantare, Dipartimento di Odontoiatria, Università Aristotele di Salonicco) e saranno conservati a -80°C fino a ulteriore elaborazione. I campioni saranno analizzati in collaborazione con il dipartimento di Biologia dell'Università Aristotele di Salonicco sotto la supervisione del professor Minas Arsenakis. Il processo sarà condotto da Ioannis Fragkioudakis e dalla dottoranda Symela Koutounidou. La selezione di questo organismo collaboratore si basa sulla precedente esperienza del Professor Minas Arsenakis nell'analisi dei polimorfismi genici e sul laboratorio completamente attrezzato situato nel dipartimento di Biologia AUTh. Inoltre, il PI, dichiara di aver avuto successo le precedenti collaborazioni con i membri dell'organizzazione selezionata.

ii. I campioni di microbiota patogeno saranno ottenuti dagli impianti selezionati mediante l'inserimento di punti di carta endodontica sterili in ciascuna fessura perimplantare. Più specificamente, i campioni saranno prelevati da Ioannis Fragkioudakis (studente post-laurea del Dipartimento di Parodontologia e Biologia implantare, Dipartimento di Odontoiatria, Università Aristotele di Salonicco) e saranno conservati a -80°C fino a ulteriore elaborazione I campioni saranno analizzati utilizzando Sequenziamento di nuova generazione (NGS). In particolare, il sequenziamento del rRNA 16S e HOMINGS saranno utilizzati per identificare l'intero microbiota incluso nei campioni, consentendo la caratterizzazione di tutti i livelli tassonomici dei batteri. L'NGS sarà condotto in collaborazione con il dipartimento di microbiologia, Medical School, A.U.Th. La scelta dell'organismo collaboratore e dei membri si basa sulla disponibilità dell'attrezzatura di laboratorio necessaria (accesso fornito dalla professoressa associata Lemonia Skoura) presso l'ospedale generale universitario AHEPA di Salonicco. Inoltre, il lavoro di laboratorio necessario sarà condotto da Fani Chatzopoulou (studente di dottorato), che ha familiarità con i processi, sotto la supervisione del Professore Associato Dimitrios Chatzidimitriou.

iii. Analisi MMP-8 Per la valutazione dei livelli di MMP-8 negli impianti selezionati verranno utilizzati test di analisi ImplantSafe rapid aMMP8. Il processo sarà il seguente: I livelli di metalloproteinasi della matrice (MMP)-8 (neutrofilo collagenasi-2) nella sua forma attiva (aMMP-8) saranno raccolti dal fluido crevicolare perimplantare, con l'ausilio delle strisce di carta incluse nel il test. Successivamente i campioni saranno analizzati quantitativamente dal lettore digitale ORALyzer® secondo le istruzioni del produttore fornendo una quantificazione istantanea dei livelli di aMMP-8. ORALyzer è in possesso del Dipartimento di Parodontologia dal 2019. Tutti i campioni saranno raccolti e analizzati da Ioannis Fragkioudakis.