Probiotický účinek na produkci dusičnanů v potravě na produkci dusitanů v plazmě (OPEDNPN) (OPEDNPN)

Pozadí

Oxid dusnatý (NO) hraje kritickou roli v nesčetných buněčných a molekulárních mechanismech regulujících fyziologii a funkci různých orgánů a systémů.1,2 Nízká biologická dostupnost NO přispívá k patologii u mnoha nemocí včetně hemolytických anémií,3 malárie,4,5 transfuze starší uložené krve,6,7 chronického srdečního selhání,8 aterosklerózy,9 a cukrovky.10 Nedávné zprávy naznačují, že orální mikrobiom je spojen s regulací homeostázy NO prostřednictvím působení určitých bakterií, které mají schopnost redukovat dusičnany na dusitany.11-15 Dusitany jsou pak dále redukovány na NO prostřednictvím různých mechanismů v různých tkáních.16,17 Plazmatický dusičnan je vychytáván zpět do dutiny ústní slinnými žlázami, takže cyklus dusičnan-dusitan-NO zajišťuje trvalé zvýšení biologické dostupnosti NO. Mnoho klinických studií používá dietní dusičnany jako zdroj NO prostřednictvím konverze dusitanů.18-24 Existuje však značná variabilita klinických výsledků v důsledku příjmu dusičnanů potravou, což se odráží ve variabilitě množství dusičnanů přeměněných na dusitany v plazmě.13,24-29 30 Variabilita a tím i velké celkové omezení účinnosti dietních léčebných postupů založených na dusičnanech bylo připisováno schopnosti orálního mikrobiomu redukovat dusičnany na dusitany.24-27 Byly zahájeny přípravné práce na identifikaci bakteriálních kmenů, které jsou účinnými konvertory dusičnanů na dusitany i těch, které skutečně inhibují konverzi dusičnanů na dusitany.31,32 Účinnost cyklu dusičnan-dusitan-NO a role ústních bakterií mohou přispět k normálnímu zdraví.11 Pochopení variability přeměny dusičnanů na dusitany a aspektů orálního mikrobiomu by tedy mohlo vést ke zlepšení normálního kardiovaskulárního zdraví. Kromě toho, abychom maximalizovali přínosy z dietních intervencí dusičnanů, musíme porozumět faktorům orálního mikrobiomu, které ovlivňují přeměnu dusičnanů na dusitany. Nedávno jsme zjistili, že několik druhů Lactobacillus produkuje metabolit, který otupuje konverzi dusičnanů na dusitany jinými orálními bakteriemi in vitro. Některé z těchto druhů Lactobacillus jsou hlavní složkou komerčně dostupného orálního probiotika, https://www.amazon.com/Dental-Probiotics-Breath-Gingivitis-Throat/dp/B096SZSFFS

Účel

Účelem této studie je určit, zda Lactobacillus otupí přeměnu dusičnanů na dusitany v plazmě.

Předpokládáme, že přítomnost orálního Lactobacillus ztlumí přeměnu dusičnanů v potravě na dusitany v plazmě a otestujeme to porovnáním přeměny před a po použití tohoto probiotika.

Hlavní hypotéza spočívá na pomocné hypotéze, že užívání perorálního probiotika povede ke zvýšenému výskytu Lactobacillus v dutině ústní a bude to testováno pomocí genomového sekvenování.

Metody OPEDNPN Všichni způsobilí dobrovolníci obdrží souhlas poté, co se seznámí se studií a souhlasí s účastí. Dobrovolníci budou náhodně rozděleni do jedné ze dvou skupin: (1) Probiotika a (2) Placebo. Studie se zúčastní celkem 20 dobrovolníků (10 na skupinu). Jediný rozdíl pro účastníky pro každou skupinu bude v tom, zda dostanou placebo nebo probiotika.

Všichni dobrovolníci se zúčastní dvou návštěv: (1) návštěva 1, základní stav a (2) návštěva 2, následná. Při každé návštěvě se dobrovolníci hlásí do místnosti 208 fyzické laboratoře Olin poté, co předtím 3 hodiny hladovali. Hodinu před návštěvou mohou pít vodu. Účastníci budou poučeni, aby v den návštěvy nepoužívali antibakteriální ústní vodu. Účastník bude požádán, aby poskytl 4 ml slin a člen studijního týmu odebere bakteriální vzorek ze zadního dorzálního povrchu jeho jazyka (jak je popsáno níže). Tyto vzorky budou zmrazeny na -80 stupňů pro genetickou analýzu a identifikaci bakteriálních kmenů.

Po odebrání vzorků slin a jazyka bude odebrána krev (jak je popsáno níže) pro stanovení dusitanů a dusičnanů v plazmě. Tento krevní vzorek bude "před" vzorkem odebraným na začátku a při následném sledování. Dobrovolníci poté vypijí jednu 70ml dávku Beet it Sport Nitrate 400 (https://www.beet-it.us/pages/beet-it-sports). Po 2,5 hodinách po konzumaci šťávy z červené řepy bude odebrán odběr krve.

Při návštěvě 1, po druhém odběru krve, dostanou dobrovolníci 7 dní buď probiotika, nebo placebo. Dobrovolníci budou konzumovat probiotika (nebo placebo) podle pokynů výrobce probiotik jednou denně. V den 8 se dobrovolníci vrátí na návštěvu 2.

Údaje budou zahrnovat (1) základní a následnou analýzu orálních bakteriálních kmenů a (2) hladiny dusitanů a dusičnanů v plazmě spotřebované před a po řepné šťávě. Předpokládáme, že početnost Lactobacillus bude vyšší při sledování ve srovnání s výchozí hodnotou u dobrovolníků užívajících probiotika, ale že ve skupině s placebem nedojde k žádné změně. Také předpokládáme, že změna dusitanů v plazmě (post minus pre) bude nižší při sledování než na začátku u dobrovolníků užívajících probiotika, ale že nedojde k žádné změně ve skupině s placebem.

• Studijní materiály (všechny komerčně dostupné):

  1. Placebo: Mentos žvýkací mátové tablety
  2. Herbiotika orální + Ent probiotikum
  3. Beet it Sport Nitrate 400 shot
• Odběr slin a škrábání jazyka. Dobrovolníci se budou hlásit do místnosti 208 fyzické laboratoře Olin poté, co se předtím postili 3 hodiny. Hodinu před návštěvou mohou pít vodu. Účastníci budou poučeni, aby v den návštěvy nepoužívali antibakteriální ústní vodu. Účastník bude požádán, aby poskytl 4 ml slin plivnutím do mikrocentrifugační zkumavky. Pro vzorky jazyka bude k odběru škrábanců použit 6" sterilní tampon HydraFlock s polystyrénovou rukojetí (Puritan Medical). Dobrovolníci budou požádáni, aby co nejvíce otevřeli ústa a vyplazili jazyk. Ze zadní 1/3 dorzálního povrchu jazyka bude odebrán vzorek lehkým až středně pevným seškrábnutím dorzálního povrchu jazyka tam a zpět. Seškrábání bude trvat asi minutu. Stěr z jazyka se vloží do 0,85 ml pufrovaného sterilního fyziologického roztoku a 0,15 ml glycerolu. Všechny vzorky budou zmrazeny na -80 °C a zaslány profesoru Hariom Yadavovi na University of South Florida ke genomové analýze.
• Odběry a zpracování krve Krev bude odebrána certifikovaným vyškoleným flebotomem. Po souhlasu budou účastníkům odebrány vzorky krve (maximálně ~10 ml). Krev bude odebrána při každé návštěvě před a 2,5 hodiny po konzumaci řepné šťávy. Krev bude odebrána co nejblíže 2,5 hodině. Ve skutečnosti k tomu může dojít mezi 2 až 3 hodinami po konzumaci posledního studijního nápoje. Krev bude odebrána laboratorním personálem s certifikovaným školením o flebotomii pomocí standardních metod venepunkce nebo pomocí zařízení Tasso HemolinkTM. HemoLinkTM je zařízení pro odběr krve schválené FDA, které používá malé lancety a jemné sání k odběru velmi malého vzorku (~ ¼ čajové lžičky) krve. Krev bude odebírána do standardních zkumavek pro odběr krve (např. citrát (modrý vrch), EDTA (fialový vrch) a heparin (zelený vrch)) a příslušně označeny. Výhodná zkumavka je 4 ml heparinová zkumavka. Všechny vzorky krve odebrané pro výzkumné účely budou identifikovány číslem účastníka studie a datem/časem odběru, které budou rovněž zaznamenány na standardizovaném formuláři pro odběr dat. Vzorky zpracovávané pro výzkumné účely nebudou obsahovat žádné osobní identifikační údaje. Všechny krevní vzorky budou okamžitě okamžitě odstředěny v odstředivce při 600-800 g po dobu pěti minut a supernatant se shromáždí. Plazma bude zmražena na suchém ledu a poté uložena při -80 °C pro analýzu obsahu dusitanů a dusičnanů.
• Konzumace probiotik nebo placeba Probiotika i placebo budou konzumovány dvakrát denně podle pokynů pro probiotika. Jedna tobolka se žvýká nebo se nechá rozpustit v ústech dobrovolníka a poté se obsah v ústech přehodí, než se spolkne.

Rizika Pacientům, kteří se chtějí zúčastnit, bude odebráno přibližně 10 ml krve. To bude provedeno obvyklým způsobem, příprava místa vpichu pomocí lokálního anestetika EMLA a následný odběr krve pomocí motýlkové jehly malého kalibru (23 nebo 21). Odběr krve ze žíly může být spojen s nepohodlím nebo modřinami v místě vpichu jehly. Vzácně se mohou objevit mdloby nebo infekce v místě vpichu jehly. Veškerá krev bude odebrána osobě vyškolené v flebotomii. Nebude žádný způsob, jak vysledovat krev zpět k dárci.

Nejsou známa žádná zdravotní rizika při darování slin nebo škrábanců z jazyka od jedinců, kteří budou zařazeni do studie. Existuje velmi minimální riziko propojení jednotlivců se studií. Nebude žádný způsob, jak vysledovat škrábance ze slin nebo jazyka zpět k dárci.

Ochrana před rizikem Strategie ochrany před rizikem. Kvůli ochraně soukromí účastníků a důvěrnosti výzkumných dat nebudou žádné osobní informace týkající se jednotlivých účastníků spojeny se studiemi in vitro.

Plány lékařské péče. V případě zranění (což je krajně nepravděpodobné) v důsledku darování slin, budou jednotlivci instruováni, aby kontaktovali svého lékaře a lékařská péče bude nabídnuta a zpoplatněna podle dostupného pokrytí výzkumu vedeného na Wake Forest School of Medicine.

V případě zranění v důsledku odběru krve budou pacienti instruováni, aby kontaktovali svého lékaře, a lékařská péče bude nabídnuta a zpoplatněna podle dostupného výzkumného pokrytí vedeného na Wake Forest School of Medicine. Krev odebraná v areálu Reynolda není klinickým prostředím, ale krev bude odebírána vyškolenými flebotomy s letitými zkušenostmi, kteří udržují svůj výcvik.

Jakékoli neočekávané problémy, závažné a neočekávané nepříznivé události, odchylky nebo změny protokolu budou okamžitě hlášeny hlavním zkoušejícím nebo určeným členem výzkumného týmu IRB a sponzorovi nebo příslušné vládní agentuře, je-li to vhodné.

Náhodné nálezy. Neočekává se, že by v této studii byly objeveny žádné náhodné nálezy, protože měření bakteriálního snížení dusičnanů nejsou v současné době klinicky relevantní, takže zvláštní, individuální výsledek v tomto měření by nemělo cenu sdělovat.

Hodnocení velikosti vzorku a statistická analýza

Plánujeme zapsat 10 účastníků, kteří dostávají probiotika a 10 účastníků, kteří dostávají placebo. Předpokládáme, že pomocí párového t-testu budou mít účastníci užívající probiotika významně (P < 0,05) nižší změna dusitanů v plazmě (post minus pre) při sledování ve srovnání s výchozí hodnotou, zatímco nebude mít žádný významný účinek placeba (párový t-test).

Vypočítali jsme, že bychom měli 80% sílu k měření 75% snížení změny dusitanů při sledování ve srovnání s výchozí hodnotou pro probiotickou skupinu s 10 účastníky na skupinu (kontinuální cíl dva nezávislé vzorky). Na základě předchozích údajů z naší laboratoře jsme předpokládali 60% směrodatnou odchylku ve změně dusitanů pro sledování oproti výchozí hodnotě.