Probiotisch effect op de productie van nitraat en plasmanitriet in de voeding (OPEDNPN) (OPEDNPN)

Achtergrond

Stikstofmonoxide (NO) speelt een cruciale rol in een groot aantal cellulaire en moleculaire mechanismen die de fysiologie en functie van verschillende organen en systemen reguleren.1,2 De lage biologische beschikbaarheid van NO draagt ​​bij aan de pathologie bij meerdere ziekten, waaronder hemolytische anemieën,3 malaria,4,5 transfusie van ouder opgeslagen bloed,6,7 chronisch hartfalen,8 atherosclerose,9 en diabetes.10 Recente rapporten suggereren dat het orale microbioom verband houdt met het reguleren van NO-homeostase door de werking van bepaalde bacteriën die het vermogen hebben om nitraat tot nitriet te reduceren.11-15 Nitriet wordt vervolgens verder gereduceerd tot NO via verschillende mechanismen in verschillende weefsels.16,17 Plasmanitraat wordt door de speekselklieren weer in de mondholte opgenomen, zodat de nitraat-nitriet-NO-cyclus zorgt voor een aanhoudende toename van de biologische beschikbaarheid van NO. In veel klinische onderzoeken is nitraat uit de voeding gebruikt als bron van NO via nitrietomzetting.18-24 Er bestaat echter een aanzienlijke variabiliteit in de klinische uitkomsten als gevolg van de inname van nitraat via de voeding, en dit wordt weerspiegeld in de variabiliteit in de hoeveelheid nitraat die wordt omgezet in plasmanitriet.13,24-29 30De variabiliteit en dus een grote algemene beperking in de werkzaamheid van behandelingen op basis van nitraat via de voeding wordt toegeschreven aan het vermogen van het orale microbioom om nitraat tot nitriet te reduceren.24-27 Er is een begin gemaakt met het identificeren van bacteriestammen die efficiënte nitraat-naar-nitriet-omzetters zijn, maar ook stammen die de nitraat-naar-nitriet-omzetting feitelijk remmen.31,32 De efficiëntie van de nitraat-nitriet-NO-cyclus en de rol van mondbacteriën kunnen bijdragen aan een normale gezondheid.11 Het begrijpen van de variabiliteit in de omzetting van nitraat in nitriet en aspecten van het orale microbioom zou dus kunnen leiden tot verbeteringen in de normale cardiovasculaire gezondheid. Om de voordelen van nitraatinterventies via de voeding te maximaliseren, moeten we bovendien de factoren van het orale microbioom begrijpen die de omzetting van nitraat in nitriet beïnvloeden. We hebben onlangs ontdekt dat verschillende soorten Lactobacillus een metaboliet produceren die de omzetting van nitraat in nitriet door andere orale bacteriën in vitro afzwakt. Verschillende van deze Lactobacillus-soorten zijn het hoofdbestanddeel van een in de handel verkrijgbaar oraal probioticum, https://www.amazon.com/Dental-Probiotics-Breath-Gingivitis-Throat/dp/B096SZSFFS

Doel

Het doel van deze studie is om te bepalen of Lactobacillus de omzetting van nitraat uit de voeding in plasmanitriet zal afremmen.

We veronderstellen dat de aanwezigheid van orale Lactobacillus de omzetting van voedingsnitraat in plasmanitriet zal afremmen en zullen dit testen door de conversie vóór en na gebruik van dit probioticum te vergelijken.

De hoofdhypothese berust op de hulphypothese dat het gebruik van het orale probioticum zal resulteren in een verhoogde overvloed aan Lactobacillus in de mondholte en dit zal testen door middel van genomische sequencing.

Methoden OPEDNPN Alle vrijwilligers die in aanmerking komen, krijgen toestemming nadat ze kennis hebben genomen van het onderzoek en akkoord zijn gegaan met deelname. Vrijwilligers worden willekeurig toegewezen aan een van de twee groepen: (1) Probiotica en (2) Placebo. In totaal zullen 20 vrijwilligers (10 per groep) aan het onderzoek deelnemen. Het enige verschil voor de deelnemers voor elke groep is of ze de placebo of het probioticum krijgen.

Alle vrijwilligers zullen deelnemen aan twee bezoeken: (1) Bezoek 1, basislijn en (2) Bezoek 2, vervolgbezoek. Bij elk bezoek zullen vrijwilligers zich melden bij de Olin Physical Lab-kamer 208 nadat ze 3 uur eerder hebben gevast. Een uur voor het bezoek mogen ze water drinken. Deelnemers krijgen de instructie om op de dag van het bezoek geen antibacterieel mondwater te gebruiken. De deelnemer wordt gevraagd om 4 ml speeksel af te geven en een lid van het onderzoeksteam verzamelt een bacteriemonster van het achterste dorsale oppervlak van zijn tong (zoals hieronder beschreven). Deze monsters worden bij -80 graden ingevroren voor genetische analyse en identificatie van bacteriestammen.

Nadat speeksel- en tongmonsters zijn afgenomen, wordt bloed afgenomen (zoals hieronder beschreven) voor bepaling van plasmanitriet en nitraat. Dit bloedmonster zal het "pre-" monster zijn dat bij de basislijn en bij de follow-up wordt verzameld. Vrijwilligers drinken dan één Beet it Sport Nitrate 400-shot van 70 ml (https://www.beet-it.us/pages/beet-it-sports). Er wordt 2,5 uur na consumptie van het bietensap een bloedafname "post-" afgenomen.

Bij bezoek 1, na de tweede bloedafname, krijgen de vrijwilligers gedurende 7 dagen een probioticum of een placebo. Vrijwilligers zullen het probioticum (of placebo) eenmaal daags consumeren zoals aangegeven door de fabrikant van het probioticum. Op dag 8 komen de vrijwilligers terug voor bezoek 2.

De gegevens omvatten (1) basislijn- en vervolganalyse van orale bacteriestammen en (2) plasmanitriet- en nitraatniveaus vóór en na de consumptie van bietensap. We veronderstellen dat de overvloed aan Lactobacillus bij de follow-up hoger zal zijn vergeleken met de uitgangswaarde voor vrijwilligers die het probioticum gebruiken, maar dat er geen verandering zal zijn in de placebogroep. We veronderstellen ook dat de verandering in plasmanitriet (post minus pre) bij de follow-up lager zal zijn dan bij aanvang voor vrijwilligers die het probioticum gebruiken, maar dat er geen verandering zal zijn in de placebogroep.

• Studiemateriaal (allemaal in de handel verkrijgbaar):

  1. Placebo: Mentos kauwmunttabletten
  2. Herbiotics Oraal + Ent Probioticum
  3. Beet it Sport Nitraat 400 shot
• Verzameling van speeksel en tongschrapen. Vrijwilligers zullen zich melden bij de Olin Physical Lab kamer 208 nadat ze vooraf 3 uur hebben gevast. Een uur voor het bezoek mogen ze water drinken. Deelnemers krijgen de instructie om op de dag van het bezoek geen antibacterieel mondwater te gebruiken. De deelnemer wordt gevraagd om 4 ml speeksel toe te dienen door in een microcentrifugebuisje te spugen. Voor de tongmonsters wordt een HydraFlock 15 cm steriel groot kudde-wattenstaafje met polystyreen handvat (Puritan Medical) gebruikt om schraapsel te verzamelen. Vrijwilligers wordt gevraagd hun mond zo wijd mogelijk te openen en hun tong uit te steken. Het achterste 1/3e deel van het dorsale oppervlak van de tong wordt bemonsterd door het dorsale oppervlak van de tong licht tot matig stevig heen en weer te schrapen. Het schrapen duurt ongeveer een minuut. Het tongschraapsel wordt in 0,85 ml gebufferde steriele zoutoplossing en 0,15 ml glycerol geplaatst. Alle monsters worden ingevroren bij -80°C en voor genomische analyse naar professor Hariom Yadav van de Universiteit van Zuid-Florida gestuurd.
• Bloedafname en verwerking Bloed wordt afgenomen door een gecertificeerde, opgeleide flebotomist. Bloedmonsters (maximaal ~10 ml) worden na toestemming van de deelnemers afgenomen. Bij elk bezoek wordt vóór en 2,5 uur na de consumptie van bietensap bloed afgenomen. Er wordt zo dicht mogelijk bij de 2,5 uur-markering bloed afgenomen. Realistisch gezien kan dit gebeuren tussen 2 en 3 uur nadat de laatste onderzoeksdrank is genuttigd. Bloed wordt afgenomen door laboratoriumpersoneel met gecertificeerde aderlatingstraining via standaard venapunctiemethoden of het Tasso HemolinkTM-apparaat. De HemoLinkTM is een door de FDA goedgekeurd bloedafnameapparaat dat kleine lancetten en zachte zuigkracht gebruikt om een ​​zeer klein bloedmonster (~ ¼ theelepels) af te nemen. Bloed wordt afgenomen in standaard bloedafnamebuisjes (bijv. citraat (blauwe bovenkant), EDTA (paarse bovenkant) en heparine (groene bovenkant)) en op de juiste manier geëtiketteerd. Het voorkeursbuisje is een heparinebuisje van 4 ml. Alle bloedmonsters die voor onderzoeksdoeleinden worden afgenomen, worden geïdentificeerd aan de hand van het deelnemersnummer van de studie en de datum/tijd van afname, die ook wordt vastgelegd op het gestandaardiseerde gegevensverzamelingsformulier. Er zal geen persoonlijk identificeerbare informatie worden opgenomen op de monsters die voor onderzoeksdoeleinden worden verwerkt. Alle bloedmonsters worden onmiddellijk gedurende vijf minuten in een centrifuge bij 600-800 g gecentrifugeerd en het supernatant wordt verzameld. Het plasma wordt ingevroren op droogijs en vervolgens bewaard bij -80°C voor analyse van het nitriet- en nitraatgehalte.
• Probiotica- of placeboconsumptie Zowel het probioticum als de placebo worden twee keer per dag geconsumeerd volgens de instructies voor het probioticum. Eén capsule wordt gekauwd of men laat deze smelten in de mond van de vrijwilliger en vervolgens wordt de inhoud in de mond verwisseld voordat deze wordt doorgeslikt.

Risico's Er zal ongeveer 10 ml bloed worden afgenomen van patiënten die willen deelnemen. Dit zal op de gebruikelijke manier gebeuren, waarbij de venapunctieplaats wordt voorbereid met het plaatselijke verdovingsmiddel EMLA en vervolgens bloed wordt afgenomen door een kleine vlindernaald (23 of 21). Bloed afnemen uit een ader kan gepaard gaan met ongemak of blauwe plekken op de plaats van de naaldpunctie. In zeldzame gevallen kan flauwvallen of een infectie op de plaats van de naaldpunctie optreden. Al het bloed wordt afgenomen van een persoon die is opgeleid in aderlaten. Er zal geen manier zijn om het bloed terug te leiden naar de donor.

Er zijn geen gezondheidsrisico's bekend voor het doneren van speeksel of tongschraapsel van personen die in het onderzoek zullen worden opgenomen. Er is een zeer minimaal risico dat personen aan het onderzoek worden gekoppeld. Er is geen manier om het speeksel of het tongschraapsel terug te leiden naar de donor.

Bescherming tegen risico's Strategieën voor bescherming tegen risico's. Om de privacy van deelnemers en de vertrouwelijkheid van onderzoeksgegevens te beschermen, worden er geen persoonlijke gegevens van individuele deelnemers aan de in vitro onderzoeken gekoppeld.

Plannen voor medische aandacht. In geval van letsel (wat uiterst onwaarschijnlijk is) als gevolg van speekseldonatie, zullen de personen worden geïnstrueerd contact op te nemen met hun arts en zal medische zorg worden aangeboden en in rekening worden gebracht op basis van de beschikbare onderzoeksdekking die wordt beheerd door de Wake Forest School of Medicine.

In geval van letsel als gevolg van bloedafname, zullen de patiënten worden geïnstrueerd contact op te nemen met hun arts en zal medische zorg worden aangeboden en in rekening worden gebracht op basis van de beschikbare onderzoeksdekking die wordt beheerd door de Wake Forest School of Medicine. Bloedafname op de Reynolda-campus is geen klinische setting, maar bloed zal worden afgenomen door getrainde flebotomisten met jarenlange ervaring die hun opleiding behouden.

Eventuele onverwachte problemen, ernstige en onverwachte bijwerkingen, afwijkingen of protocolwijzigingen zullen onmiddellijk door de hoofdonderzoeker of een aangewezen lid van het onderzoeksteam worden gerapporteerd aan de IRB en de sponsor of de bevoegde overheidsinstantie, indien van toepassing.

Incidentele bevindingen. Er worden in dit onderzoek geen incidentele bevindingen verwacht, aangezien maatregelen voor de reductie van bacteriële nitraat momenteel niet van klinische relevantie zijn, dus een vreemd, individueel resultaat in die maatregel zou niet de moeite waard zijn om te communiceren.

Beoordeling van de steekproefomvang en statistische analyse

We zijn van plan om 10 deelnemers in te schrijven die het probioticum krijgen en 10 deelnemers die de placebo krijgen. We veronderstellen dat deelnemers die het probioticum gebruiken, met behulp van een gepaarde t-test significant (P <.05) lagere verandering in plasmanitriet (post minus pre) bij follow-up vergeleken met de uitgangssituatie, terwijl er geen significant effect van de placebo zal zijn (gepaarde t-test).

We berekenden dat we een power van 80% zouden hebben om een ​​afname van 75% in de verandering in nitriet bij de follow-up te meten vergeleken met de uitgangswaarde voor de probiotische groep met 10 deelnemers per groep (continu eindpunt twee onafhankelijke monsters). We gingen uit van een standaardafwijking van 60% in de verandering in nitriet voor follow-up versus uitgangswaarde op basis van eerdere gegevens uit ons laboratorium.