Wpływ probiotyczny na produkcję azotanów w diecie na produkcję azotynów w osoczu (OPEDPNN) (OPEDNPN)

Tło

Tlenek azotu (NO) odgrywa kluczową rolę w niezliczonej liczbie mechanizmów komórkowych i molekularnych regulujących fizjologię i funkcjonowanie różnych narządów i układów.1,2 Niska biodostępność NO przyczynia się do patologii w wielu chorobach, w tym w niedokrwistości hemolitycznej3, malarii4,5, transfuzji starszej przechowywanej krwi6,7 w przewlekłej niewydolności serca8, miażdżycy9 i cukrzycy.10 Ostatnie doniesienia sugerują, że mikrobiom jamy ustnej jest powiązany z regulacją homeostazy NO poprzez działanie niektórych bakterii, które mają zdolność redukcji azotanów do azotynów.11-15 Azotyn jest następnie redukowany do NO poprzez różne mechanizmy w różnych tkankach.16,17 Azotan osocza jest pobierany z powrotem do jamy ustnej przez gruczoły ślinowe, dzięki czemu cykl azotan-azotyn-NO zapewnia trwały wzrost biodostępności NO. W wielu badaniach klinicznych wykorzystano azotany z diety jako źródło NO poprzez konwersję azotynów.18-24 Istnieje jednak znaczna zmienność wyników klinicznych wynikająca z spożycia azotanów w diecie, co znajduje odzwierciedlenie w zmienności ilości azotanów przekształcanych w azotyny w osoczu.13,24-29 30 Zmienność, a co za tym idzie duże ogólne ograniczenie skuteczności terapii opartych na azotanach w diecie, przypisuje się zdolności mikrobiomu jamy ustnej do redukcji azotanów do azotynów.24-27 Rozpoczęto wstępne prace nad identyfikacją szczepów bakterii, które skutecznie konwertują azotany do azotynów, a także tych, które faktycznie hamują konwersję azotanów do azotynów.31,32 Efektywność cyklu azotan-azotyn-NO i rola bakterii jamy ustnej mogą przyczyniać się do prawidłowego zdrowia.11 Zatem zrozumienie zmienności konwersji azotanów do azotynów i aspektów mikrobiomu jamy ustnej może prowadzić do poprawy prawidłowego stanu układu sercowo-naczyniowego. Ponadto, aby zmaksymalizować korzyści z interwencji w zakresie azotanów w diecie, musimy zrozumieć czynniki mikrobiomu jamy ustnej, które wpływają na konwersję azotanów do azotynów. Niedawno odkryliśmy, że kilka gatunków Lactobacillus wytwarza metabolit, który osłabia konwersję azotanów do azotynów przez inne bakterie jamy ustnej in vitro. Kilka z tych gatunków Lactobacillus jest głównym składnikiem dostępnego na rynku doustnego probiotyku, https://www.amazon.com/Dental-Probiotics-Breath-Gingivitis-Throat/dp/B096SZSFFS

Zamiar

Celem tego badania jest określenie, czy Lactobacillus będzie stępiać konwersję azotanów z diety do azotynów w osoczu.

Stawiamy hipotezę, że obecność doustnych bakterii Lactobacillus osłabi konwersję azotanów z diety do azotynów w osoczu i przetestujemy to, porównując konwersję przed i po zastosowaniu tego probiotyku.

Główna hipoteza opiera się na hipotezie pomocniczej, że stosowanie doustnego probiotyku spowoduje zwiększoną liczebność Lactobacillus w jamie ustnej, co zostanie sprawdzone poprzez sekwencjonowanie genomu.

Metody OPEDPNN Wszyscy kwalifikujący się ochotnicy uzyskają zgodę po zapoznaniu się z badaniem i wyrażeniu zgody na udział. Ochotnicy zostaną losowo przydzieleni do jednej z dwóch grup: (1) probiotyków i (2) placebo. W badaniu weźmie udział łącznie 20 ochotników (10 na grupę). Jedyną różnicą dla uczestników w każdej grupie będzie to, czy otrzymają placebo czy probiotyk.

Wszyscy wolontariusze wezmą udział w dwóch wizytach: (1) wizyta 1, punkt odniesienia i (2) wizyta 2, wizyta kontrolna. Podczas każdej wizyty ochotnicy zgłaszają się do sali 208 Laboratorium Fizycznego Olin po uprzednim poszczeniu przez 3 godziny. Na godzinę przed wizytą mogą pić wodę. Uczestnicy zostaną poinstruowani, aby w dniu wizyty nie stosować płynu antybakteryjnego do płukania jamy ustnej. Uczestnik zostanie poproszony o dostarczenie 4 ml śliny, a członek zespołu badawczego pobierze próbkę bakterii z tylnej powierzchni grzbietowej języka (jak opisano poniżej). Próbki te zostaną zamrożone w temperaturze -80 stopni w celu analizy genetycznej i identyfikacji szczepów bakteryjnych.

Po pobraniu próbek śliny i języka zostanie pobrana krew (w sposób opisany poniżej) w celu oznaczenia azotynów i azotanów w osoczu. Ta próbka krwi będzie próbką „przed” pobraną na początku badania i podczas obserwacji. Następnie ochotnicy wypiją jeden shot 70 ml Beet it Sport Nitrate 400 (https://www.beet-it.us/pages/beet-it-sports). Krew „po” zostanie pobrana 2,5 godziny po spożyciu soku z buraków.

Podczas wizyty 1, po drugim pobraniu krwi, ochotnicy otrzymają probiotyk lub placebo na 7 dni. Ochotnicy będą spożywać probiotyk (lub placebo) raz dziennie zgodnie ze wskazaniami producenta probiotyku. W dniu 8 wolontariusze powrócą na wizytę 2.

Dane będą obejmować (1) analizę wyjściową i późniejszą szczepów bakterii jamy ustnej oraz (2) poziom azotynów i azotanów w osoczu przed i po spożyciu soku z buraków. Stawiamy hipotezę, że w przypadku ochotników przyjmujących probiotyk liczebność Lactobacillus będzie wyższa w czasie obserwacji w porównaniu do wartości wyjściowych, ale w grupie placebo nie będzie żadnych zmian. Stawiamy również hipotezę, że u ochotników przyjmujących probiotyk zmiana stężenia azotynów w osoczu (po minus przed) będzie niższa w czasie obserwacji niż na początku badania, ale w grupie placebo nie będzie żadnej zmiany.

• Materiały do ​​nauki (wszystkie dostępne na rynku):

  1. Placebo: Mentos miętowe tabletki do żucia
  2. Herbicyny doustne + Ent Probiotyk
  3. Beet it Sport Nitrate 400 shot
• Pobieranie skrobania ze śliny i języka. Ochotnicy zgłoszą się do sali 208 Laboratorium Fizycznego Olin po uprzednim poszczeniu przez 3 godziny. Na godzinę przed wizytą mogą pić wodę. Uczestnicy zostaną poinstruowani, aby w dniu wizyty nie stosować płynu antybakteryjnego do płukania jamy ustnej. Uczestnik zostanie poproszony o oddanie 4 ml śliny poprzez wyplucie do probówki mikrowirówki. W przypadku próbek języka do zebrania zeskrobin zostanie użyty sterylny wymazówka o dużym rozmiarze floku HydraFlock 6 cali z uchwytem z polistyrenu (Puritan Medical). Ochotnicy zostaną poproszeni o jak najszersze otwarcie ust i wysunięcie języka. Pobrana zostanie próbka z tylnej 1/3 grzbietowej powierzchni języka poprzez lekkie lub średnio mocne zeskrobanie grzbietowej powierzchni języka w tę i z powrotem. Zdrapywanie zajmie około minuty. Zeskrobina z języka zostanie umieszczona w 0,85 ml buforowanej sterylnej soli fizjologicznej i 0,15 ml gliceryny. Wszystkie próbki zostaną zamrożone w temperaturze -80°C i wysłane do profesora Harioma Yadava na Uniwersytecie Południowej Florydy w celu analizy genomicznej.
• Pobieranie i przetwarzanie krwi Krew będzie pobierana przez certyfikowanego, przeszkolonego flebotomistę. Od uczestników po wyrażeniu zgody zostaną pobrane próbki krwi (maksymalnie ~10 ml). Krew będzie pobierana podczas każdej wizyty przed i 2,5 godziny po spożyciu soku z buraków. Krew zostanie pobrana możliwie najbliżej 2,5 godziny. Realistycznie rzecz biorąc, może to nastąpić od 2 do 3 godzin po spożyciu ostatniego badanego napoju. Krew będzie pobierana przez personel laboratorium przeszkolony w zakresie upuszczania krwi przy użyciu standardowych metod wkłucia żyły lub urządzenia Tasso HemolinkTM. HemoLinkTM to zatwierdzone przez FDA urządzenie do pobierania krwi, które wykorzystuje małe lancety i delikatne zasysanie w celu pobrania bardzo małej próbki krwi (~ ¼ łyżeczki) krwi. Krew będzie pobierana do standardowych probówek do pobierania krwi (np. cytrynian (na górze niebieska), EDTA (na górze fioletowa) i heparyna (na górze zielona)) i odpowiednio oznakowane. Preferowaną probówką jest probówka z heparyną o pojemności 4 ml. Wszystkie próbki krwi pobrane do celów badawczych zostaną zidentyfikowane na podstawie numeru uczestnika badania oraz daty/godziny pobrania, co zostanie również zapisane w standardowym formularzu gromadzenia danych. Na próbkach przetwarzanych do celów badawczych nie będą umieszczane żadne dane osobowe. Wszystkie próbki krwi zostaną natychmiast odwirowane w wirówce przy 600–800 g przez pięć minut i zebrany supernatant. Osocze zostanie zamrożone w suchym lodzie, a następnie przechowywane w temperaturze -80°C w celu analizy zawartości azotynów i azotanów.
• Spożycie probiotyku lub placebo Zarówno probiotyk, jak i placebo będą spożywane dwa razy dziennie zgodnie z instrukcją dla probiotyku. Jedną kapsułkę żuje się lub pozostawia do rozpuszczenia w ustach ochotnika, a następnie zawartość zamienia się w jamie ustnej przed połknięciem.

Zagrożenia Od pacjentów chcących wziąć udział w badaniu zostanie pobrane około 10 ml krwi. Należy to zrobić w zwykły sposób, przygotowując miejsce wkłucia żyły za pomocą miejscowego środka znieczulającego EMLA, a następnie pobierając krew przez igłę motylkową o małym rozmiarze (23 lub 21). Pobieranie krwi z żyły może wiązać się z dyskomfortem lub zasinieniem w miejscu wkłucia igłą. Rzadko może wystąpić omdlenie lub zakażenie w miejscu wkłucia igłą. Cała krew zostanie pobrana od osoby przeszkolonej w zakresie upuszczania krwi. Nie będzie możliwości prześledzenia pochodzenia krwi do dawcy.

Nie są znane żadne zagrożenia dla zdrowia związane z oddawaniem śliny lub zeskrobin z języka od osób, które zostaną uwzględnione w badaniu. Ryzyko powiązania poszczególnych osób z badaniem jest bardzo minimalne. Nie będzie możliwości ustalenia pochodzenia śliny lub zeskrobin języka do dawcy.

Zabezpieczenia przed ryzykiem Strategie ochrony przed ryzykiem. Aby chronić prywatność uczestników i poufność danych badawczych, żadne dane osobowe poszczególnych uczestników nie będą łączone z badaniami in vitro.

Plany opieki medycznej. W przypadku odniesienia obrażeń (co jest niezwykle mało prawdopodobne) w wyniku oddania śliny, badana osoba zostanie poinstruowana, aby skontaktowała się z lekarzem, a opieka medyczna zostanie zaoferowana w ramach dostępnych badań prowadzonych w Wake Forest School of Medicine.

W przypadku obrażeń w wyniku pobrania krwi pacjenci zostaną poinstruowani, aby skontaktowali się z lekarzem, a opieka medyczna zostanie zaoferowana i opłacona w ramach dostępnych badań prowadzonych w Wake Forest School of Medicine. Krew pobierana na kampusie Reynoldda nie jest środowiskiem klinicznym, ale krew będzie pobierana przez przeszkolonych flebotomistów z wieloletnim doświadczeniem, którzy stale się szkolą.

Wszelkie nieprzewidziane problemy, poważne i nieoczekiwane zdarzenia niepożądane, odstępstwa lub zmiany w protokole zostaną niezwłocznie zgłoszone przez głównego badacza lub wyznaczonego członka zespołu badawczego IRB oraz sponsorowi lub odpowiedniej agencji rządowej, jeśli to konieczne.

Przypadkowe ustalenia. Nie oczekuje się, że w tym badaniu zostaną odkryte żadne przypadkowe wyniki, ponieważ pomiary redukcji azotanów bakteryjnych nie mają obecnie znaczenia klinicznego, więc nie warto podawać dziwnych, indywidualnych wyników tego pomiaru.

Ocena liczebności próby i analiza statystyczna

Planujemy zapisać 10 uczestników, którzy otrzymają probiotyk i 10 uczestników, którzy otrzymają placebo. Stawiamy hipotezę, że stosując test t dla par, uczestnicy przyjmujący probiotyk będą mieli znacząco (P < 0,05) niższa zmiana stężenia azotynów w osoczu (po minus przed) podczas wizyty kontrolnej w porównaniu z wartością wyjściową, podczas gdy nie będzie znaczącego wpływu placebo (test t dla par).

Obliczyliśmy, że mielibyśmy 80% mocy, aby zmierzyć 75% spadek zmiany azotynów podczas obserwacji kontrolnej w porównaniu z wartością wyjściową dla grupy probiotycznej z 10 uczestnikami na grupę (ciągły punkt końcowy Dwie niezależne próbki). Na podstawie poprzednich danych z naszego laboratorium założyliśmy 60% odchylenie standardowe zmiany azotynów w okresie obserwacji w porównaniu z wartością wyjściową.