Влияние пробиотиков на продукцию пищевых нитратов и нитритов в плазме (OPEDNPN) (OPEDNPN)

Фон

Оксид азота (NO) играет решающую роль во множестве клеточных и молекулярных механизмов, регулирующих физиологию и функции различных органов и систем.1,2 Низкая биодоступность NO способствует развитию патологии при многих заболеваниях, включая гемолитическую анемию,3 малярию,4,5 переливание старой запасенной крови,6,7 хроническую сердечную недостаточность,8 атеросклероз9 и диабет10. Недавние сообщения показывают, что микробиом полости рта связан с регуляцией гомеостаза NO посредством действия определенных бактерий, которые обладают способностью восстанавливать нитраты до нитритов.11-15 Затем нитрит восстанавливается до NO посредством различных механизмов в разных тканях.16,17 Нитрат плазмы попадает обратно в полость рта слюнными железами, так что цикл нитрат-нитрит-NO обеспечивает устойчивое увеличение биодоступности NO. Во многих клинических исследованиях пищевые нитраты использовались в качестве источника NO посредством преобразования нитритов.18-24 Однако существует значительная вариабельность клинических исходов из-за потребления нитратов с пищей, и это отражается на вариабельности количества нитратов, превращающихся в нитриты плазмы.13,24-29 30 Вариабельность и, следовательно, большое общее ограничение эффективности лечения на основе диетических нитратов объясняется способностью микробиома полости рта восстанавливать нитраты до нитритов.24-27 Началась предварительная работа по выявлению бактериальных штаммов, которые являются эффективными преобразователями нитратов в нитриты, а также тех, которые фактически ингибируют превращение нитратов в нитриты.31,32 Эффективность цикла нитрат-нитрит-NO и роль бактерий полости рта могут способствовать нормальному здоровью.11 Таким образом, понимание изменчивости превращения нитратов в нитриты и аспектов микробиома полости рта может привести к улучшению нормального сердечно-сосудистого здоровья. Кроме того, чтобы максимизировать пользу от воздействия диетических нитратов, нам необходимо понять факторы микробиома полости рта, которые влияют на преобразование нитратов в нитриты. Недавно мы обнаружили, что несколько видов Lactobacillus производят метаболит, который притупляет преобразование нитратов в нитриты другими бактериями полости рта in vitro. Некоторые из этих видов Lactobacillus являются основным компонентом коммерчески доступного пробиотика для перорального применения, https://www.amazon.com/Dental-Probiotics-Breath-Gingivitis-Throat/dp/B096SZSFFS.

Цель

Цель этого исследования — определить, будут ли Lactobacillus притуплять превращение пищевых нитратов в нитриты плазмы.

Мы предполагаем, что присутствие Lactobacillus при пероральном приеме будет притуплять превращение пищевых нитратов в нитрит плазмы, и проверим это, сравнивая превращение до и после использования этого пробиотика.

Основная гипотеза основана на вспомогательной гипотезе о том, что использование перорального пробиотика приведет к увеличению численности лактобактерий в полости рта и позволит проверить это с помощью геномного секвенирования.

Методы OPEDNPN Все подходящие добровольцы получат согласие после того, как узнают об исследовании и согласятся на участие. Добровольцы будут случайным образом распределены в одну из двух групп: (1) пробиотик и (2) плацебо. Всего в исследовании примут участие 20 добровольцев (по 10 на группу). Единственная разница для участников каждой группы будет заключаться в том, получат ли они плацебо или пробиотик.

Все волонтеры примут участие в двух визитах: (1) визит 1, исходный и (2) визит 2, последующий контроль. При каждом посещении добровольцы будут приходить в комнату 208 физической лаборатории Олина после 3-часового голодания. Пить воду можно за час до посещения. Участникам будет дано указание не использовать антибактериальную жидкость для полоскания рта в день посещения. Участника попросят предоставить 4 мл слюны, а член исследовательской группы возьмет образец бактерий с задней дорсальной поверхности языка (как описано ниже). Эти образцы будут заморожены при температуре -80 градусов для генетического анализа и идентификации бактериальных штаммов.

После сбора образцов слюны и языка берут кровь (как описано ниже) для определения нитритов и нитратов в плазме. Этот образец крови будет «предварительным» образцом, собранным в начале исследования и при последующем наблюдении. Затем волонтеры выпьют одну порцию Beet it Sport Nitrate 400 объемом 70 мл (https://www.beet-it.us/pages/beet-it-sports). «Пост-» анализ крови будет взят через 2,5 часа после употребления свекольного сока.

Во время первого визита, после второго забора крови, добровольцы получат пробиотик или плацебо в течение 7 дней. Добровольцы будут употреблять пробиотик (или плацебо) в соответствии с указаниями производителя пробиотика один раз в день. На 8-й день волонтеры вернутся на второй визит.

Данные будут включать (1) исходный и последующий анализ пероральных бактериальных штаммов и (2) уровни нитритов и нитратов в плазме до и после употребления свекольного сока. Мы предполагаем, что численность Lactobacillus будет выше при последующем наблюдении по сравнению с исходным уровнем у добровольцев, принимавших пробиотик, но в группе плацебо изменений не произойдет. Мы также предполагаем, что изменение уровня нитритов в плазме (после минус до) будет ниже при последующем наблюдении, чем на исходном уровне, у добровольцев, принимавших пробиотик, но в группе плацебо изменений не будет.

• Учебные материалы (все коммерчески доступны):

  1. Плацебо: таблетки Mentos Chewable Mint
  2. Гербиотики Оральный + ЛОР-пробиотик
  3. Свекла Спорт Нитрат 400 шот
• Сбор слюны и соскоба с языка. Добровольцы явятся в комнату 208 физической лаборатории Олина после 3-часового голодания. Пить воду можно за час до посещения. Участникам будет дано указание не использовать антибактериальную жидкость для полоскания рта в день посещения. Участника попросят предоставить 4 мл слюны, сплюнув в пробирку для микроцентрифуги. Для взятия образцов с языка для сбора соскобов будет использоваться стерильный большой тампон HydraFlock размером 6 дюймов с полистироловой ручкой (Puritan Medical). Добровольцев попросят как можно шире открыть рот и высунуть язык. Пробу берут с задней 1/3 дорсальной поверхности языка путем легкого или умеренно твердого соскабливания дорсальной поверхности языка вперед и назад. Соскоб займет около минуты. Соскоб с языка помещают в 0,85 мл забуференного стерильного физиологического раствора и 0,15 мл глицерина. Все образцы будут заморожены при температуре -80°C и отправлены профессору Хариому Ядаву в Университет Южной Флориды для геномного анализа.
• Забор и обработка крови. Кровь будет брать сертифицированный, обученный флеботомист. Образцы крови (максимум ~ 10 мл) будут взяты у участников после согласия. Кровь будет собираться при каждом посещении до и через 2,5 часа после употребления свекольного сока. Кровь будет взята как можно ближе к отметке 2,5 часа. На самом деле это может произойти через 2–3 часа после употребления последнего исследуемого напитка. Кровь будет брать персонал лаборатории, имеющий сертифицированную подготовку по флеботомии, с использованием стандартных методов венепункции или устройства Tasso HemolinkTM. HemoLink™ — это устройство для взятия крови, одобренное FDA, в котором используются небольшие ланцеты и мягкое всасывание для сбора очень небольшого образца (~ ¼ чайной ложки) крови. Кровь будет собираться в стандартные пробирки для забора крови (например, цитрат (синий верх), ЭДТА (фиолетовый верх) и гепарин (зеленый верх)) и маркированы соответствующим образом. Предпочтительной пробиркой является пробирка с гепарином объемом 4 мл. Все образцы крови, взятые в исследовательских целях, будут идентифицироваться по номеру участника исследования и дате/времени взятия, которые также будут записаны в стандартизированной форме сбора данных. Никакая личная информация не будет включена в образцы, обработанные в исследовательских целях. Все образцы крови немедленно центрифугируются при 600-800 g в течение пяти минут и собираются супернатант. Плазму замораживают на сухом льду, а затем хранят при температуре -80°C для анализа содержания нитритов и нитратов.
• Употребление пробиотика или плацебо. И пробиотик, и плацебо следует принимать два раза в день в соответствии с инструкциями к пробиотику. Одну капсулу разжевывают или дают ей расплавиться во рту добровольца, а затем содержимое перемешивают во рту перед проглатыванием.

Риски У пациентов, желающих принять участие, будет взято около 10 мл крови. Это будет сделано обычным способом: место венепункции подготавливается местным анестетиком EMLA, а затем берется кровь через иглу-бабочку небольшого калибра (23 или 21). Забор крови из вены может сопровождаться дискомфортом или появлением синяков в месте прокола иглой. Редко может возникнуть обморок или инфекция в месте прокола иглы. Вся кровь будет взята у человека, обученного кровопусканию. Невозможно будет отследить кровь до донора.

Не существует известных рисков для здоровья при сдаче слюны или соскоба с языка людей, которые будут включены в исследование. Существует очень минимальный риск присоединения отдельных лиц к исследованию. Невозможно будет отследить донора по слюне или соскобу с языка.

Защита от риска Стратегии защиты от риска. В целях защиты конфиденциальности участников и конфиденциальности данных исследований никакая личная информация отдельных участников не будет связана с исследованиями in vitro.

Планы медицинской помощи. В случае травмы (что крайне маловероятно) в результате донорства слюны людям будет предложено связаться со своим врачом, и будет предложена медицинская помощь, стоимость которой будет взиматься в соответствии с имеющимся покрытием исследований, проводимым в Медицинской школе Уэйк Форест.

В случае травмы в результате взятия крови пациентам будет предложено обратиться к своему врачу, и будет предложена медицинская помощь, стоимость которой будет взиматься в рамках доступного исследовательского покрытия, проводимого в Медицинской школе Уэйк Форест. Взятие крови в кампусе Рейнольды не является клиническим мероприятием, но кровь будут брать обученные флеботомисты с многолетним опытом, которые продолжают свое обучение.

О любых непредвиденных проблемах, серьезных и неожиданных нежелательных явлениях, отклонениях или изменениях протокола главный исследователь или назначенный член исследовательской группы будет незамедлительно сообщать ЭСО и спонсору или соответствующему государственному органу, если это необходимо.

Случайные находки. Ожидается, что в этом исследовании не будет обнаружено никаких случайных результатов, поскольку показатели снижения уровня бактериальных нитратов в настоящее время не имеют клинического значения, поэтому о странных индивидуальных результатах по этому показателю не стоит сообщать.

Оценка размера выборки и статистический анализ

Мы планируем привлечь 10 участников, которые будут получать пробиотик, и 10 участников, которые будут получать плацебо. Мы предполагаем, что при использовании парного t-теста у участников, принимающих пробиотик, будет значительно (P < 0,05) более низкое изменение уровня нитритов в плазме (после минус до) при наблюдении по сравнению с исходным уровнем, хотя значимого эффекта плацебо не будет (парный t-критерий).

Мы подсчитали, что у нас будет 80% мощности для измерения 75%-ного снижения изменения содержания нитритов при последующем наблюдении по сравнению с исходным уровнем для группы пробиотиков с 10 участниками в каждой группе (непрерывная конечная точка, две независимые выборки). Мы предположили, что стандартное отклонение изменения содержания нитритов для последующего наблюдения по сравнению с исходным уровнем составит 60 %, основываясь на предыдущих данных из нашей лаборатории.