Effetto probiotico sulla produzione di nitrati alimentari rispetto alla produzione di nitriti plasmatici (OPEDNPN) (OPEDNPN)

Sfondo

L'ossido nitrico (NO) svolge un ruolo fondamentale in una miriade di meccanismi cellulari e molecolari che regolano la fisiologia e la funzione di vari organi e sistemi.1,2 La bassa biodisponibilità di NO contribuisce alla patologia di molteplici malattie tra cui anemie emolitiche,3 malaria,4,5 trasfusioni di sangue conservato più vecchio,6,7 insufficienza cardiaca cronica,8 aterosclerosi,9 e diabete.10 Rapporti recenti suggeriscono che il microbioma orale è collegato alla regolazione dell’omeostasi dell’NO attraverso l’azione di alcuni batteri che hanno la capacità di ridurre il nitrato in nitrito.11-15 Il nitrito viene poi ulteriormente ridotto a NO attraverso una varietà di meccanismi in diversi tessuti.16,17 Il nitrato plasmatico viene ripreso nella cavità orale dalle ghiandole salivari in modo che il ciclo nitrato-nitrito-NO fornisca aumenti sostenuti della biodisponibilità di NO. Molti studi clinici hanno utilizzato il nitrato alimentare come fonte di NO attraverso la conversione del nitrito.18-24 Tuttavia, esiste una sostanziale variabilità negli esiti clinici dovuta all’assunzione di nitrati con la dieta e ciò si riflette nella variabilità della quantità di nitrato convertito in nitrito plasmatico.13,24-29 30 La variabilità e quindi un'ampia limitazione complessiva dell'efficacia dei trattamenti dietetici a base di nitrati è stata attribuita alla capacità del microbioma orale di ridurre il nitrato in nitrito.24-27 È iniziato il lavoro preliminare per identificare i ceppi batterici che sono efficienti convertitori da nitrato a nitrito, nonché quelli che effettivamente inibiscono la conversione da nitrato a nitrito.31,32 L'efficienza del ciclo nitrato-nitrito-NO e il ruolo dei batteri orali possono contribuire alla normale salute.11 Pertanto, comprendere la variabilità nella conversione dei nitrati in nitriti e gli aspetti del microbioma orale potrebbe portare a miglioramenti nella normale salute cardiovascolare. Inoltre, al fine di massimizzare i benefici derivanti dagli interventi dietetici sui nitrati, dobbiamo comprendere i fattori del microbioma orale che influenzano la conversione dei nitrati in nitriti. Abbiamo recentemente scoperto che diverse specie di Lactobacillus producono un metabolita che attenua la conversione dei nitrati in nitriti da parte di altri batteri orali in vitro. Molte di queste specie di Lactobacillus sono il componente principale di un probiotico orale disponibile in commercio, https://www.amazon.com/Dental-Probiotics-Breath-Gingivitis-Throat/dp/B096SZSFFS

Scopo

Lo scopo di questo studio è determinare se il Lactobacillus riduce la conversione dei nitrati alimentari in nitriti plasmatici.

Ipotizziamo che la presenza di Lactobacillus orale smorzerà la conversione del nitrato alimentare in nitrito plasmatico e lo testeremo confrontando la conversione prima e dopo l'uso di questo probiotico.

L'ipotesi principale si basa sull'ipotesi ausiliaria secondo cui l'uso del probiotico orale comporterà un aumento dell'abbondanza di Lactobacillus nella cavità orale e lo testerà attraverso il sequenziamento genomico.

Metodi OPEDNPN Tutti i volontari idonei saranno autorizzati dopo aver appreso dello studio e aver accettato di partecipare. I volontari verranno assegnati in modo casuale a uno dei due gruppi: (1) Probiotici e (2) Placebo. Allo studio parteciperanno un totale di 20 volontari (10 per gruppo). L'unica differenza per i partecipanti di ciascun gruppo sarà se riceveranno il placebo o il probiotico.

Tutti i volontari parteciperanno a due visite: (1) Visita 1, riferimento e (2) Visita 2, follow-up. Ad ogni visita, i volontari si presenteranno alla stanza 208 dell'Olin Physical Lab dopo aver digiunato per 3 ore prima. Possono bere acqua un'ora prima della visita. Ai partecipanti verrà richiesto di non utilizzare collutori antibatterici il giorno della visita. Al partecipante verrà chiesto di fornire 4 ml di saliva e un membro del team di studio raccoglierà un campione batterico dalla superficie dorsale posteriore della lingua (come descritto di seguito). Questi campioni verranno congelati a -80 gradi per l'analisi genetica e l'identificazione dei ceppi batterici.

Dopo aver raccolto i campioni di saliva e lingua, verrà prelevato il sangue (come descritto di seguito) per la determinazione dei nitriti e dei nitrati plasmatici. Questo campione di sangue sarà il campione "pre-" raccolto al basale e al follow-up. I volontari berranno quindi uno shot di Beet it Sport Nitrate 400 da 70 ml (https://www.beet-it.us/pages/beet-it-sports). Un prelievo di sangue "post-" verrà raccolto 2,5 ore dopo il consumo del succo di barbabietola.

Alla visita 1, dopo il secondo prelievo di sangue, i volontari riceveranno un probiotico o un placebo per 7 giorni. I volontari consumeranno il probiotico (o il placebo) come indicato dal produttore del probiotico una volta al giorno. Il giorno 8, i volontari torneranno per la visita 2.

I dati includeranno (1) analisi di base e di follow-up di ceppi batterici orali e (2) livelli plasmatici di nitriti e nitrati prima e dopo il consumo di succo di barbabietola. Ipotizziamo che l'abbondanza di Lactobacillus sarà maggiore al follow-up rispetto al basale per i volontari che assumono il probiotico, ma che non ci sarà alcun cambiamento nel gruppo placebo. Ipotizziamo inoltre che la variazione dei nitriti plasmatici (post meno pre) sarà inferiore al follow-up rispetto al basale per i volontari che assumono il probiotico, ma che non ci sarà alcun cambiamento nel gruppo placebo.

• Materiali di studio (tutti disponibili in commercio):

  1. Placebo: Mentos compresse masticabili alla menta
  2. Erbiotici orali + probiotici otorinolaringoiatrici
  3. Colpo di Beet it Sport Nitrate 400
• Raccolta della saliva e raschiamento della lingua. I volontari si presenteranno alla stanza 208 dell'Olin Physical Lab dopo aver digiunato per 3 ore prima. Possono bere acqua un'ora prima della visita. Ai partecipanti verrà richiesto di non utilizzare collutori antibatterici il giorno della visita. Al partecipante verrà chiesto di fornire 4 ml di saliva sputando in una provetta da microcentrifuga. Per i campioni della lingua, verrà utilizzato un tampone floccato sterile HydraFlock da 6 pollici con manico in polistirolo (Puritan Medical) per raccogliere i raschiati. Ai volontari verrà chiesto di aprire la bocca il più possibile e di tirare fuori la lingua. Il 1/3 posteriore della superficie dorsale della lingua verrà campionato raschiando da leggero a moderatamente deciso la superficie dorsale della lingua avanti e indietro. La raschiatura richiederà circa un minuto. Il raschietto della lingua verrà posto in 0,85 mL di soluzione salina sterile tamponata e 0,15 mL di glicerolo. Tutti i campioni verranno congelati a -80°C e inviati al Professor Hariom Yadav presso l'Università della Florida del Sud per l'analisi genomica.
• Prelievi e trattamento del sangue Il sangue verrà prelevato da un prelievo qualificato e qualificato. I campioni di sangue (massimo ~ 10 ml) verranno raccolti dai partecipanti previo consenso. Il sangue verrà raccolto ad ogni visita prima e 2,5 ore dopo il consumo di succo di barbabietola. Il sangue verrà prelevato il più vicino possibile al limite delle 2,5 ore. Realisticamente, potrebbe verificarsi tra 2 e 3 ore dopo il consumo della bevanda finale dello studio. Il sangue verrà prelevato da personale di laboratorio con formazione certificata sulla prelievi tramite metodi di venipuntura standard o dispositivo Tasso HemolinkTM. HemoLinkTM è un dispositivo per la raccolta del sangue approvato dalla FDA che utilizza piccole lancette e un'aspirazione delicata per raccogliere un campione molto piccolo (~ ¼ cucchiaino) di sangue. Il sangue verrà raccolto in provette standard per la raccolta del sangue (ad es. citrato (parte superiore blu), EDTA (parte superiore viola) ed eparina (parte superiore verde)) ed etichettati in modo appropriato. La provetta preferita è una provetta di eparina da 4 ml. Tutti i campioni di sangue prelevati a fini di ricerca saranno identificati dal numero del partecipante allo studio e dalla data/ora di raccolta, che saranno registrati anche sul modulo standardizzato di raccolta dati. Nessuna informazione identificativa personale sarà inclusa nei campioni trattati a fini di ricerca. Tutti i campioni di sangue verranno immediatamente centrifugati in una centrifuga a 600-800 g per cinque minuti e il surnatante verrà raccolto. Il plasma verrà congelato su ghiaccio secco e poi conservato a -80°C per l'analisi del contenuto di nitriti e nitrati.
• Consumo di probiotici o placebo Sia il probiotico che il placebo verranno consumati due volte al giorno secondo le istruzioni per il probiotico. Una capsula viene masticata o lasciata sciogliere nella bocca del volontario, quindi il contenuto viene scambiato in bocca prima di essere deglutito.

Rischi Verranno prelevati circa 10 ml di sangue dai pazienti disposti a partecipare. Questa operazione verrà eseguita nel modo consueto, preparando il sito di venipuntura con l'anestetico locale EMLA, quindi prelevando il sangue attraverso un ago a farfalla di piccolo calibro (23 o 21). Il prelievo di sangue da una vena può essere associato a disagio o lividi nel sito di puntura dell'ago. Raramente possono verificarsi svenimenti o infezioni nel sito di puntura dell’ago. Tutto il sangue verrà prelevato da una persona addestrata alla flebotomia. Non ci sarà modo di risalire al sangue del donatore.

Non sono noti rischi per la salute derivanti dalla donazione di saliva o da raschiamenti della lingua da parte di individui che saranno inclusi nello studio. Il rischio di collegare gli individui allo studio è minimo. Non ci sarà modo di risalire al donatore dalla saliva o dai raschiati della lingua.

Protezioni dai rischi Strategie di protezione dai rischi. Per proteggere la privacy dei partecipanti e la riservatezza dei dati della ricerca, nessuna informazione personale riguardante i singoli partecipanti sarà collegata agli studi in vitro.

Piani per l'assistenza medica. In caso di lesioni (cosa estremamente improbabile) a seguito della donazione di saliva, alle persone verrà chiesto di contattare il proprio medico e l'assistenza medica verrà offerta e addebitata in base alla copertura di ricerca disponibile mantenuta presso la Wake Forest School of Medicine.

In caso di lesioni a seguito del prelievo di sangue, i pazienti verranno istruiti a contattare il proprio medico e le cure mediche verranno offerte e addebitate in base alla copertura di ricerca disponibile mantenuta presso la Wake Forest School of Medicine. Il sangue prelevato nel campus di Reynolda non è un ambiente clinico, ma il sangue verrà prelevato da prelievi addestrati con anni di esperienza che mantengono la loro formazione.

Eventuali problemi imprevisti, eventi avversi gravi e inattesi, deviazioni o modifiche al protocollo saranno tempestivamente segnalati dal ricercatore principale o dal membro designato del gruppo di ricerca all'IRB e allo sponsor o all'agenzia governativa appropriata, se appropriato.

Risultati accidentali. Non si prevede che in questo studio vengano scoperti risultati accidentali poiché le misure di riduzione dei nitrati batterici non hanno attualmente rilevanza clinica, quindi un risultato strano e individuale in tale misura non varrebbe la pena di essere comunicato.

Valutazione della dimensione del campione e analisi statistica

Prevediamo di iscrivere 10 partecipanti che ricevono il probiotico e 10 partecipanti che ricevono il placebo. Ipotizziamo che, utilizzando un t-test appaiato, i partecipanti che assumono il probiotico avranno significativamente (P < 0,05) variazione inferiore dei nitriti plasmatici (post minus pre) al follow-up rispetto al basale mentre non ci sarà alcun effetto significativo del placebo (t-test appaiato).

Abbiamo calcolato che avremmo una potenza dell'80% per misurare una diminuzione del 75% nella variazione dei nitriti al follow-up rispetto al basale per il gruppo probiotico con 10 partecipanti per gruppo (endpoint continuo: due campioni indipendenti). Abbiamo ipotizzato una deviazione standard del 60% nella variazione dei nitriti per il follow-up rispetto al basale sulla base dei dati precedenti del nostro laboratorio.