Proteomická a histologická analýza ligamentum flavum v bederní stenóze (APIDeLeG)

Úvod bederní páteřní stenóza (LSS) je vysoce převládající stav po celém světě, charakterizovaný zúžením páteřního kanálu. Epidemiologické studie naznačují vysoký výskyt LSS, ovlivněných demografickými posuny a rostoucí zatížení muskuloskeletálních poruch souvisejících s věkem. Etiologie LSS je primárně klasifikována jako získaná (degenerativní) nebo vrozená, což postihuje přibližně 103 milionů jednotlivců po celém světě. Degenerativní forma se stává stále běžnější s postupem věku. Anatomicky je degenerativní LSS rozdělen na centrální, laterální a foraminální stenózu s nejvyšší prevalencí pozorovanou na úrovni L4-L5. Mezi klíčové etiologické faktory patří zesílení a deformace ligamentum flavum (LF), často vyplývající ze snížené výšky disku, chettové kloubové hypertrofie nebo kombinace obou. Mezi těmito faktory je hypertrofie ligamentum flavum (LFH) považována za primární příčinu stenózy bederního páteře (LSC).

LF je klíčová struktura spojující laminu sousedních obratlů, složených přibližně 80% elastických vláken a 20% kolagenových vláken. Hraje zásadní roli při vytváření zadní hranice páteřního kanálu, zabrání nadměrné flexi obratlového sloupce a udržování stability páteře. Několik studií ukazuje, že jedinci s hypertrofickým LF vykazují redukci a dezorganizaci elastických vláken, doprovázených zvýšením kolagenových vláken, což naznačuje, že LFH je poháněn fibrotickým procesem. Identifikace rizikových faktorů pro LFH zůstává náročná a je předmětem probíhající debaty v literatuře; Věk a mechanický stres jsou v současné době považováni za nejvýznamnější přispěvatele.

Jen málo studií se zaměřilo na objasnění molekulárních mechanismů, které jsou základem LSS a LFH nebo na identifikaci specifických diagnostických a prognostických biomarkerů. Výsledkem je, že patofyziologie a molekulární základ LSS a LFH zůstávají špatně pochopeny a zdůrazňují potřebu přesné molekulární charakterizace a rozvoj cílených léčby založených na specifických molekulách.

Zhao et al. identifikoval významné zvýšení exprese trombospondin-1 (THBS1) v LFH pomocí proteomiky a jednobuněčné RNA sekvenování v klinických vzorcích. Laboratorní experimenty prokázaly, že THBS1 aktivuje signální dráhu Smad3 prostřednictvím transformačního růstového faktoru P1 (TGF-pi), což zvyšuje expresi fibrotických markerů Col1a2 a a-SMA. Bipedální myší model potvrdil klíčovou roli THBS1 ve vývoji LFH. Navíc bylo prokázáno, že Sestrin2 (SESN2), protein reagující na stres, potlačuje expresi THBS1 a brání fibróze v LF buňkách. Tato zjištění naznačují, že mechanické přetížení zvyšuje produkci THBS1 a spouští dráhu TGF-pi/Smad3 a vede k tkáňové hypertrofii. Potlačení exprese THBS1 by mohlo poskytnout nový terapeutický přístup pro LFH.

V jiné studii Wang et al. zjistili, že amyloid divokého typu transthyretin (ATTRWT) byl přítomen ve vzorcích LF od pacientů podstupujících dekompresní chirurgii, přičemž amyloidní zátěž pozitivně koreluje s tloušťkou LF a bederní LF zatížení v závislosti na dávce.

Liu et al. uvedli, že hypertrofické vzorky LF vykazovaly vyšší hladiny CLU, TGF-P1, a-SMA, ALK5 a fosforylovaných Smad3 proteinů ve srovnání se vzorky Non-LFH. Bylo zjištěno, že mechanické napětí a TGF-pi indukují expresi klastrinu (CLU) v LF buňkách. Zejména CLU inhiboval expresi COL1A2 a a-SMA, které byly stimulovány mechanickým stresem a TGF-pi. Mechanistické studie prokázaly, že CLU potlačila mechanický stres indukovanou a TGF-P1-řízenou aktivitu SMAD3 inhibicí fosforylace Smad3 a jaderné translokaci prostřednictvím konkurenční vazby s ALK5. Navíc PRKD3 stabilizoval CLU protein, čímž brání jeho lysozomální degradaci. Experimenty in vivo ukázaly, že Clu oslaboval LFH indukovaný mechanickým stresem. Tyto výsledky naznačují, že CLU zmírňuje LFH modulací signálních drah TGF-pi jak in vitro, tak in vivo, působí jako negativní regulátor zpětné vazby TGF-P1 a inhibující fibrotické odpovědi v LF.

Zheng et al. zjistil, že TGF-pi významně zvýšila expresi mRNA CRLF1 cestou Smad3. Bylo zjištěno, že CRLF1 zvyšuje LF fibrózu prostřednictvím signální dráhy ERK na post-transkripční úrovni a byl nezbytný pro profibrotické účinky TGF-pi. Když byl CRLF1 umlčen, byla snížena fibróza indukovaná zánětlivými cytokiny a mechanickým stresem. Experimenty dále prokázaly, že bipedální držení by mohlo indukovat LFH a zvýšit expresi CRLF1 u myší. Nadměrná exprese CRLF1 vedla k LFH in vivo, zatímco umlčení CRLF1 zabránilo vývoji LFH u bipedálních myší.

Tyto studie zdůrazňují kritickou roli specifických molekul ve vývoji a regulaci LFH. Patogeneze však zůstává neúplně objasněna. K objasnění těchto mechanismů a vývoji potenciálních strategií pro prevenci a léčbu LFH a LSS je nutný další výzkum.

Cíle cílů a cílů klinických studií (hypotéza a očekávané výsledky) Cílem této studie je provádět komplexní klinické a proteomické zkoumání LFH, porovnávat molekulární profily různých vzorků LF v dobře definované kohortě pacienta, která splňuje kritéria inkluze a má statisticky významnou velikost vzorku. Proteomika je cenným nástrojem pro studium onemocnění na molekulární úrovni a pomáhá objasnit mechanismy zapojené do zánětlivých reakcí a biomechanického stresu.

Konkrétně se klinická proteomika, jak je použita v tomto projektu, zaměřuje na biomedicínské použití proteomiky a integruje proteomiku, epidemiologii, klinickou chemii a lékařské disciplíny, což dokonale sladí s cíli studie. Tento přístup zahrnuje stanovení celkového profilu exprese proteinu specifické buňky, tkáně nebo tělesné tekutiny v daném čase, hodnocení kvalitativních a kvantitativních rozdílů mezi zdravými a nemocnými subjekty.

Tento projekt integruje více výzkumných jednotek, kde kliničtí lékaři, neurochirurgové, biochemisté a molekulární biologové úzce spolupracují na dosažení požadovaných výsledků, z nichž každá přispívá ke své odbornosti ke studii.

Návrh studie

3.1 Typ studie: prospektivní, jednorázová observační studie.

3.2 Doba trvání studie: Studie začne po schválení etickou komisí a bude trvat 36 měsíců.

3.3 Koncové body studie

3.3.1 Primární koncový bod

Prozkoumejte molekulární a histologické aspekty prostřednictvím proteomické a mikroskopické analýzy za účelem identifikace potenciálního specifického vzoru u pacientů s LSS a jejich porovnání se zdravou populací.

3.3.2 Sekundární koncové body

Korelovat výsledky krevních testů (rutinní klinický odběr krve) se specifickým LFH vzorem.

Posoudit korelace mezi nálezy předoperačního zobrazování a intraoperačními a molekulárními výsledky.

3.4 Experimentální postupy

Poskytněte molekulární charakterizaci ligamentum flavum ve dvou populacích studie (nedegenerativní onemocnění vs. degenerativní onemocnění) prostřednictvím aplikace integrovaného proteomického přístupu založeného na platformách shora dolů a zdola nahoru. Data by mohla poskytnout cenné vhled do molekulárních mechanismů, které jsou základem nástupu a progresi onemocnění.

Identifikujte molekulární biomarkery pro klinické aplikace: Analýza různých vzorků ligamentum flavum by mohla odhalit specifické proteiny spojené s páteřní stenózou a objasnit mechanismy regulující tyto cesty. Identifikace těchto biomarkerů by mohla významně zlepšit léčbu bederní páteřní stenózy zavedením nových terapeutických cílů ke zmírnění zánětlivých a hypertrofických reakcí, pomalé progrese stenózy a nakonec zvýšením kvality života pacientů.

Analýza dat a velikost vzorku

5.1 Velikost vzorku Vzhledem k povaze studie není nutná formální stanovení velikosti vzorku. Na základě počtu pacientů léčených každoročně odhadujeme zápis 100 pacientů, kteří splňují kritéria pro zařazení a vyloučení do 24 měsíců a popisují jejich proteomické vzorce. Vzorky ligamentum flavum budou získány od 50 pacientů podstupujících dekompresní chirurgii pro bederní páteřní stenózu a ve srovnání se vzorky od 50 pacientů podstupujících chirurgii pro jiná degenerativní onemocnění míchy.

5.2 Histologická analýza Vzorky budou obarveny a zkoumány za účelem detekce změn ve složení kolagenových a elastinových vláken, buněčnosti a přítomnosti zánětlivých markerů. K kvantifikaci změn tkáně budou použity pokročilé zobrazovací techniky.

5.3 Molekulární analýza RNA a proteinové extrakty ze vzorků ligamentum flavum budou analyzovány pomocí technik, jako je QPCR, western blotting a imunohistochemie za účelem identifikace změn genu a proteinu souvisejících s fibrózou, zánětem a extracelulární matricovou remodelací.

5.4 Vzorky proteomické analýzy budou podléhat proteomické analýze pomocí platforem hmotnostní spektrometrie a využívají integrované přístupy shora dolů a zdola nahoru.

5.5 Statistická analýza kvantitativní proměnné po normálním rozdělení budou shrnuty jako průměrná a standardní odchylka (SD) nebo jinak jako medián a mezikvartilní rozsah (IQR).

Kategorické proměnné budou hlášeny jako absolutní a relativní frekvence (procento).

Normalita proměnných bude hodnocena pomocí testu Shapiro-Wilk. Srovnání mezi kategorickými proměnnými bude provedeno pomocí testu chí-kvadrát nebo Fisherova přesného testu.

Rozdíly mezi kvantitativními proměnnými budou testovány pomocí Studentova t-testu nebo Mann-Whitneyho testu.

Předoperační a pooperační klinická data, funkční výsledky a výsledky zobrazování budou shromažďovány a korelovány s histologickými a molekulárními daty k identifikaci potenciálních biomarkerů a prediktorů chirurgických výsledků prostřednictvím lineární regresní analýzy.

Korelace mezi různými parametry bude dále vyhodnocena výpočtem korelačního koeficientu Pearsona a/nebo Spearmana.

Výsledky budou považovány za statisticky významné při p <0,05. Analýzy budou prováděny pomocí R Statistického softwaru (R, CRAN).