Analyse protéomique et histologique du ligament flavum dans la sténose lombaire (APIDeLeG)

Introduction La sténose vertébrale lombaire (LSS) est une condition très répandue dans le monde, caractérisée par le rétrécissement du canal vertébral. Les études épidémiologiques indiquent une incidence élevée de LSS, influencée par les changements démographiques et la charge croissante des troubles musculo-squelettiques liés à l'âge. L'étiologie du LSS est principalement classée comme acquise (dégénérative) ou congénitale, affectant environ 103 millions d'individus dans le monde. La forme dégénérative devient de plus en plus courante avec l'âge avancé. Anatomiquement, le LSS dégénératif est subdivisé en sténose centrale, latérale et foraminale, avec la prévalence la plus élevée observée au niveau L4-L5. Les facteurs étiologiques clés comprennent l'épaississement et la déformation du ligament flavum (LF), résultant souvent d'une hauteur du disque réduite, d'une hypertrophie articulaire des facettes ou d'une combinaison des deux. Parmi ces facteurs, l'hypertrophie du ligament flavum (LFH) est reconnue comme la principale cause de la sténose du canal vertébral lombaire (LSC).

La LF est une structure cruciale reliant les lamelles des vertèbres adjacentes, composées d'environ 80% de fibres élastiques et de fibres de collagène à 20%. Il joue un rôle vital dans la formation de la frontière postérieure du canal vertébral, empêchant une flexion excessive de la colonne vertébrale et le maintien de la stabilité vertébrale. Plusieurs études indiquent que les individus atteints de LF hypertrophique présentent une réduction et une désorganisation des fibres élastiques, accompagnées d'une augmentation des fibres de collagène, suggérant que la LFH est entraînée par un processus fibrotique. L'identification des facteurs de risque de LFH reste difficile et fait l'objet d'un débat en cours dans la littérature; L'âge et le stress mécanique sont actuellement considérés comme les contributeurs les plus importants.

Peu d'études se sont concentrées sur l'élucidation des mécanismes moléculaires sous-jacents à LSS et LFH ou sur l'identification de biomarqueurs diagnostiques et pronostiques spécifiques. En conséquence, la physiopathologie et la base moléculaire de LSS et de LFH restent mal comprises, soulignant la nécessité d'une caractérisation moléculaire précise et le développement de traitements ciblés basés sur des molécules spécifiques.

Zhao et al. a identifié une augmentation significative de l'expression de la thrombospondine-1 (THBS1) dans la LFH en utilisant la protéomique et le séquençage d'ARN unique dans des échantillons cliniques. Les expériences de laboratoire ont démontré que THBS1 active la voie de signalisation SMAD3 via la transformation du facteur de croissance β1 (TGF-β1), améliorant l'expression des marqueurs fibrotiques COL1A2 et α-SMA. Un modèle murin bipède a confirmé le rôle crucial de THBS1 dans le développement de LFH. De plus, SESSIN2 (SESN2), une protéine sensible au stress, s'est avérée supprimer l'expression de THBS1, empêchant la fibrose dans les cellules LF. Ces résultats suggèrent que la surcharge mécanique augmente la production de THBS1, déclenchant la voie TGF-β1 / SMAD3 et conduisant à une hypertrophie tissulaire. La suppression de l'expression de THBS1 pourrait fournir une nouvelle approche thérapeutique pour LFH.

Dans une autre étude, Wang et al. ont constaté que la transthyrétine amyloïde de type sauvage (ATTRWT) était présente dans les échantillons de LF de patients subissant une chirurgie de décompression, la charge amyloïde en corrélation positivement avec l'épaisseur de la LF et la charge LF lombaire d'une manière dose-dépendante.

Liu et al. ont rapporté que les échantillons de LF hypertrophiques présentaient des niveaux plus élevés de protéines SMAD3 CLU, TGF-β1, α-SMA, ALK5 et phosphorylées par rapport aux échantillons non-LFH. Le stress mécanique et le TGF-β1 induisent l'expression de la clusterine (CLU) dans les cellules LF. Notamment, CLU a inhibé l'expression de Col1a2 et α-SMA, qui ont été stimulées par le stress mécanique et le TGF-β1. Des études mécanistes ont démontré que CLU supprimait l'activité SMAD3 induite par le stress mécanique et le TGF-β1 en inhibant la phosphorylation de Smad3 et la translocation nucléaire par une liaison compétitive avec ALK5. De plus, PRKD3 a stabilisé la protéine CLU, empêchant sa dégradation lysosomale. Des expériences in vivo ont montré que CLU atténuait la LFH induite par la contrainte mécanique. Ces résultats suggèrent que les CLU atténuent la LFH en modulant les voies de signalisation TGF-β1 in vitro et in vivo, agissant comme un régulateur de rétroaction négatif du TGF-β1 et inhibant les réponses fibrotiques dans la LF.

Zheng et al. ont découvert que le TGF-β1 augmentait significativement l'expression de l'ARNm de CRLF1 via la voie SMAD3. CRLF1 s'est avéré améliorer la fibrose LF par la voie de signalisation ERK au niveau post-transcriptionnel et était essentiel pour les effets pro-fibrotiques du TGF-β1. Lorsque le CRLF1 a été réduit au silence, la fibrose induite par les cytokines inflammatoires et le stress mécanique a été réduite. De plus, les expériences ont démontré que la posture bipède pouvait induire la LFH et une expression de CRLF1 accrue chez la souris. La surexpression de CRLF1 a conduit à LFH in vivo, tandis que le silençage CRLF1 a empêché le développement de LFH chez les souris bipèdes.

Ces études mettent en évidence le rôle critique de molécules spécifiques dans le développement et la régulation de la LFH. Cependant, la pathogenèse reste incomplètement élucidée. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour clarifier ces mécanismes et développer des stratégies potentielles pour la prévention et le traitement de LFH et LSS.

Objectifs et objectifs des essais cliniques (hypothèse et résultats attendus) L'objectif de cette étude est de mener une étude clinique et protéomique complète de la LFH, en comparant les profils moléculaires de différents échantillons de LF au sein d'une cohorte de patient bien définie qui répond aux critères d'inclusion et a une taille d'échantillon statistiquement significative. La protéomique est un outil précieux pour étudier les maladies au niveau moléculaire, aidant à élucider les mécanismes impliqués dans les réponses inflammatoires et le stress biomécanique.

Plus précisément, la protéomique clinique, appliquée dans ce projet, se concentre sur l'application biomédicale de la protéomique et intègre la protéomique, l'épidémiologie, la chimie clinique et les disciplines médicales, s'alignant parfaitement avec les objectifs de l'étude. Cette approche consiste à déterminer le profil d'expression des protéines totales d'une cellule, d'un tissu ou d'un liquide corporel spécifique à un moment donné, évaluant les différences qualitatives et quantitatives entre les sujets sains et malades.

Ce projet intègre plusieurs unités de recherche, où les cliniciens, les neurochirurgiens, les biochimistes et les biologistes moléculaires collaborent étroitement pour atteindre les résultats souhaités, chacun contribuant à leur expertise à l'étude.

Conception de l'étude

3.1 Type d'étude: étude observationnelle prospective et monocentrique.

3.2 Durée de l'étude: L'étude commencera après l'approbation du comité d'éthique et durera 36 mois.

3.3 Étude des points de terminaison

3.3.1 Témain principal

Étudier les aspects moléculaires et histologiques par analyse protéomique et microscopique pour identifier un schéma spécifique potentiel chez les patients LSS, les comparant à une population saine.

3.3.2 Point de terminaison secondaire

Corréler les résultats des tests sanguins (échantillonnage de sang clinique de routine) avec un schéma LFH spécifique.

Évaluer les corrélations entre les résultats de l'imagerie préopératoire et les résultats peropératoires et moléculaires.

3.4 Procédures expérimentales

Fournir une caractérisation moléculaire du ligament flavum dans deux populations d'étude (maladie non dégénérative par rapport aux maladies dégénératives) grâce à l'application d'une approche protéomique intégrée basée sur des plates-formes de haut en bas et ascendantes. Les données pourraient fournir des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires sous-jacents au début et à la progression de la maladie.

Identifier les biomarqueurs moléculaires pour les applications cliniques: l'analyse de différents échantillons de ligament flavum pourrait révéler des protéines spécifiques associées à la sténose vertébrale et clarifier les mécanismes régulant ces voies. L'identification de ces biomarqueurs pourrait améliorer considérablement le traitement de la sténose vertébrale lombaire en introduisant de nouvelles cibles thérapeutiques pour atténuer les réponses inflammatoires et hypertrophiques, la progression lente de la sténose et finalement améliorer la qualité de vie des patients.

Analyse des données et taille de l'échantillon

5.1 Taille de l'échantillon Compte tenu de la nature de l'étude, une détermination formelle de la taille de l'échantillon n'est pas requise. Sur la base du nombre de patients traités chaque année, nous estimons l'inscription de 100 patients qui répondent aux critères d'inclusion et d'exclusion dans les 24 mois et décrivant leurs schémas protéomiques. Des échantillons de ligament flavum seront obtenus auprès de 50 patients subissant une chirurgie de décompression pour une sténose vertébrale lombaire et comparé à des échantillons de 50 patients subissant une intervention chirurgicale pour d'autres maladies dégénératives.

5.2 Analyse histologique Les échantillons seront colorés et examinés pour détecter les changements dans la composition des fibres de collagène et d'élastine, la cellularité et la présence de marqueurs inflammatoires. Des techniques d'imagerie avancées seront utilisées pour quantifier les altérations tissulaires.

5.3 Analyse moléculaire Les extraits d'ARN et de protéines d'échantillons de ligament flavum seront analysés en utilisant des techniques telles que QPCR, Western blot et immunohistochimie pour identifier les changements d'expression des gènes et des protéines liés à la fibrose, à l'inflammation et à la suppression de la matrice extracellulaire.

5.4 Les échantillons de ligament d'analyse protéomique subiront une analyse protéomique en utilisant des plates-formes de spectrométrie de masse, utilisant des approches de haut en bas intégrées et ascendantes.

5.5 Analyse statistique Les variables quantitatives suivant une distribution normale seront résumées en tant que moyenne et écart-type (SD) ou, sinon, en tant que gamme médiane et interquartile (IQR).

Des variables catégorielles seront signalées comme des fréquences absolues et relatives (pourcentage).

La normalité des variables sera évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Des comparaisons entre les variables catégorielles seront effectuées en utilisant le test du chi carré ou le test exact de Fisher.

Les différences entre les variables quantitatives seront testées à l'aide du test t de Student ou du test de Mann-Whitney.

Les données cliniques préopératoires et postopératoires, les résultats fonctionnels et les résultats de l'imagerie seront collectés et corrélés avec les données histologiques et moléculaires pour identifier les biomarqueurs potentiels et les prédicteurs des résultats chirurgicaux par analyse de régression linéaire.

La corrélation entre divers paramètres sera évaluée davantage en calculant le coefficient de corrélation de Pearson et / ou de Spearman.

Les résultats seront considérés comme statistiquement significatifs à p <0,05. Les analyses seront effectuées à l'aide du logiciel statistique R (R, CRAN).