Proteomische und histologische Analyse von Ligamentum flavum bei Lumbalstenose (APIDeLeG)

Einleitung Lumbale Spinalstenose (LSS) ist weltweit eine weit verbreitete Erkrankung, die durch die Verengung des Wirbelsäulenkanals gekennzeichnet ist. Epidemiologische Studien deuten auf eine hohe Inzidenz von LSS hin, die durch demografische Verschiebungen und die zunehmende Belastung durch altersbedingte muskuloskelettale Erkrankungen beeinflusst wird. Die Ätiologie von LSS wird hauptsächlich als erworben (degenerativ) oder angeboren eingestuft und betrifft weltweit ungefähr 103 Millionen Personen. Die degenerative Form wird mit dem fortschreitenden Alter immer häufiger. Anatomisch wird degenerative LSS in eine zentrale, laterale und foraminale Stenose unterteilt, wobei die höchste Prävalenz auf L4-L5-Ebene beobachtet wird. Zu den wichtigsten ätiologischen Faktoren gehören die Verdickung und Verformung des Ligamentum Flavum (LF), das häufig aus einer verringerten Scheibenhöhe, einer Facettenverbindungshypertrophie oder einer Kombination von beidem resultiert. Unter diesen Faktoren wird die Ligamentum Flavum Hypertrophie (LFH) als Hauptursache für die Lendenwirbelkanalkanalstenose (LSCs) anerkannt.

Das LF ist eine entscheidende Struktur, die die Schichten benachbarter Wirbel verbindet und aus ungefähr 80% elastischen Fasern und 20% Kollagenfasern besteht. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung der hinteren Grenze des Wirbelkanals, verhindern eine übermäßige Flexion der Wirbelsäule und die Aufrechterhaltung der Wirbelsäulenstabilität. Mehrere Studien zeigen, dass Personen mit hypertropher LF eine Reduktion und Desorganisation von elastischen Fasern aufweisen, begleitet von einer Zunahme der Kollagenfasern, was darauf hindeutet, dass LFH von einem fibrotischen Prozess angetrieben wird. Das Erkennen von Risikofaktoren für LFH bleibt eine Herausforderung und ist Gegenstand einer laufenden Debatte in der Literatur. Alter und mechanische Belastung werden derzeit als die wichtigsten Mitwirkenden angesehen.

Nur wenige Studien konzentrierten sich auf die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die LSS und LFH zugrunde liegen, oder um spezifische diagnostische und prognostische Biomarker zu identifizieren. Infolgedessen bleiben die Pathophysiologie und die molekulare Grundlage von LSS und LFH kaum verstanden, wodurch die Notwendigkeit einer präzisen molekularen Charakterisierung und der Entwicklung von gezielten Behandlungen auf der Grundlage spezifischer Moleküle beruht.

Zhao et al. identifizierte einen signifikanten Anstieg der Thrombospondin-1 (THBS1) -Expression in LFH unter Verwendung von Proteomik und Einzelzell-RNA-Sequenzierung in klinischen Proben. Laborexperimente zeigten, dass THBS1 den SMAD3-Signalweg über die transformierende Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1) aktiviert, wodurch die Expression fibrotischer Marker Col1a2 und α-SMA verstärkt werden. Ein Bipedal Mausmodell bestätigte die entscheidende Rolle von THBS1 bei der LFH -Entwicklung. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Sestrin2 (SESN2), ein stressindes Protein, die THBS1-Expression unterdrückt und Fibrose in LF-Zellen verhindert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die mechanische Überlastung die THBS1-Produktion erhöht, den TGF-β1/SMAD3-Weg auslöst und zu einer Gewebehypertrophie führt. Die Unterdrückung der THBS1 -Expression könnte einen neuartigen therapeutischen Ansatz für LFH liefern.

In einer anderen Studie haben Wang et al. fanden heraus, dass Wildtyp-Amyloid-Tranetin (ATTRWT) in LF-Proben von Patienten vorhanden war, die sich einer Dekompressionsoperation unterzogen, wobei die Amyloidbelastung positiv mit der LF-Dicke und der LUL-LF-Belastung dosisabhängig korrelierte.

Liu et al. berichteten, dass hypertrophe LF-Proben höhere Spiegel an CLU-, TGF-β1-, α-SMA-, Alk5- und Phosphorylierten SMAD3-Proteinen im Vergleich zu Nicht-LFH-Proben zeigten. Es wurde festgestellt, dass mechanische Spannung und TGF-β1 die Clusterin-Expression (CLU) in LF-Zellen induzieren. Bemerkenswerterweise inhibierte CLU die Col1A2- und α-SMA-Expression, die durch mechanische Spannung und TGF-β1 stimuliert wurden. Mechanistische Studien zeigten, dass die CLU die mechanische stressinduzierte und die TGF-β1-gesteuerte SMAD3-Aktivität durch Hemmung der SMAD3-Phosphorylierung und der Kerntranslokation durch kompetitive Bindung mit Alk5 unterdrückte. Zusätzlich stabilisierte PRKD3 CLU -Protein, wodurch der lysosomale Abbau verhindert wird. In -vivo -Experimente zeigten, dass CLU LFH durch mechanische Belastung induziert hat. Diese Ergebnisse legen nahe, dass CLU LFH durch Modulation von TGF-β1-Signalwege sowohl in vitro als auch in vivo mildern, was als negativer Rückkopplungsregulator von TGF-β1 und hemmende fibrotische Reaktionen in LF fungiert.

Zheng et al. entdeckte, dass TGF-β1 die CRLF1-mRNA-Expression über den Smad3-Weg signifikant erhöhte. Es wurde festgestellt, dass CRLF1 die LF-Fibrose durch den ERK-Signalweg auf der posttranskriptionellen Ebene verbessert und für die profibrotischen Wirkungen von TGF-β1 essentiell war. Wenn CRLF1 zum Schweigen gebracht wurde, wurde durch entzündliche Zytokine und mechanische Spannung induzierte Fibrose verringert. Darüber hinaus zeigten Experimente, dass die Bipedal -Haltung LFH und eine erhöhte CRLF1 -Expression bei Mäusen induzieren könnte. Die Überexpression von CRLF1 führte in vivo zu LFH, während die CRLF1 -Stummschaltung die LFH -Entwicklung bei Zweibedallmäusen verhinderte.

Diese Studien unterstreichen die kritische Rolle spezifischer Moleküle bei der Entwicklung und Regulation von LFH. Die Pathogenese bleibt jedoch unvollständig erläutert. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um diese Mechanismen zu klären und potenzielle Strategien für die Prävention und Behandlung von LFH und LSS zu entwickeln.

Ziele und klinische Studienziele (Hypothese und erwartete Ergebnisse) Das Ziel dieser Studie ist es, eine umfassende klinische und proteomische Untersuchung von LFH durchzuführen, wobei die molekularen Profile verschiedener LF-Proben innerhalb einer genau definierten Patientenkohorte verglichen werden, die die Einschlusskriterien entspricht und eine statistisch signifikante Stichprobengröße aufweist. Proteomics ist ein wertvolles Instrument zur Untersuchung von Krankheiten auf molekularer Ebene und dazu beiträgt, Mechanismen aufzuklären, die an Entzündungsreaktionen und biomechanischen Stress beteiligt sind.

Insbesondere konzentriert sich die klinische Proteomik, wie in diesem Projekt angewendet, auf die biomedizinische Anwendung von Proteomik und integriert Proteomik, Epidemiologie, klinische Chemie und medizinische Disziplinen und stimmt perfekt an den Zielen der Studie überein. Dieser Ansatz beinhaltet die Bestimmung des Gesamtproteinexpressionsprofils einer spezifischen Zelle, eines Gewebes oder eines Körperfluids zu einem bestimmten Zeitpunkt, wodurch qualitative und quantitative Unterschiede zwischen gesunden und erkrankten Probanden bewertet werden.

Dieses Projekt integriert mehrere Forschungseinheiten, bei denen Ärzte, Neurochirurgen, Biochemiker und Molekularbiologen eng zusammenarbeiten, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen, wodurch jeweils ihr Fachwissen zur Studie beiträgt.

Studiendesign

3.1 Studiestyp: Prospektive, einzelne Beobachtungsstudie.

3.2 Studiendauer: Die Studie beginnt nach Genehmigung durch den Ethikausschuss und dauert 36 Monate.

3.3 Studienendpunkte

3.3.1 Primärer Endpunkt

Untersuchen Sie die molekularen und histologischen Aspekte durch proteomische und mikroskopische Analyse, um ein potenziell spezifisches Muster bei LSS -Patienten zu identifizieren, wobei sie mit einer gesunden Population verglichen werden.

3.3.2 Sekundäre Endpunkte

Korrelate Blutuntersuchergebnisse (routinemäßige klinische Blutprobenahme) mit einem spezifischen LFH -Muster.

Bewerten Sie die Korrelationen zwischen präoperativen Bildgebungsergebnissen und intraoperativen und molekularen Ergebnissen.

3.4 Experimentelle Verfahren

Bereiten Sie durch die Anwendung eines integrierten proteomischen Ansatzes eine molekulare Charakterisierung des Ligamentum flavum in zwei Studienpopulationen (Nicht-Degenerative Erkrankung gegenüber degenerativen Erkrankungen) an, die auf Top-Down- und Bottom-Up-Plattformen basiert. Die Daten könnten wertvolle Einblicke in die molekularen Mechanismen liefern, die dem Beginn und dem Fortschreiten der Krankheit zugrunde liegen.

Identifizieren Sie molekulare Biomarker für klinische Anwendungen: Die Analyse verschiedener Ligamentum -Flavum -Proben könnte spezifische Proteine ​​aufzeigen, die mit der Wirbelsäulenstenose assoziiert sind, und klären Sie die Mechanismen, die diese Wege regulieren. Die Identifizierung dieser Biomarker könnte die Behandlung der Lumbalwirbelsäulenstenose signifikant verbessern, indem neue therapeutische Ziele eingeführt werden, um entzündliche und hypertrophe Reaktionen, langsame Stenose -Progressionen und letztendlich die Lebensqualität der Patienten zu verbessern.

Datenanalyse und Stichprobengröße

5.1 Stichprobengröße Angesichts der Art der Studie ist keine formale Bestimmung der Stichprobengrößen erforderlich. Basierend auf der Anzahl der jährlich behandelten Patienten schätzen wir 100 Patienten, die die Einschluss- und Ausschlusskriterien innerhalb von 24 Monaten erfüllen und ihre proteomischen Muster beschreiben. Ligamentum -Flavum -Proben werden von 50 Patienten erhalten, die sich einer Dekompression einer Dekompressionsoperation bei Lendenwirbelsäulenstenose unterziehen, und verglichen mit Proben von 50 Patienten, die sich einer Operation wegen anderer degenerativer Wirbelerkrankungen unterziehen.

5.2 Histologische Analyse Die Proben werden gefärbt und untersucht, um Veränderungen in der Zusammensetzung von Kollagen- und Elastinfasern, der Zellularität und dem Vorhandensein von Entzündungsmarkern nachzuweisen. Fortgeschrittene Bildgebungstechniken werden eingesetzt, um Gewebeveränderungen zu quantifizieren.

5.3 RNA- und Proteinextrakte der molekularen Analyse aus Ligamentum -Flavum -Proben werden unter Verwendung von Techniken wie qPCR, Western Blot und immunhistochemie analysiert, um die Veränderungen der Gene und Proteinexpression im Zusammenhang mit Fibrose, Entzündung und extrazellulärer Matrixumbau zu identifizieren.

5.4 Proben der Proteomanalyse werden unter Verwendung von Massenspektrometrieplattformen unter Verwendung integrierter Top-Down- und Bottom-up-Ansätze eine proteomische Analyse unterzogen.

5.5 Statistische Analyse quantitative Variablen nach einer Normalverteilung werden als Mittelwert und Standardabweichung (SD) oder ansonsten als Median- und Interquartilbereich (IQR) zusammengefasst.

Kategoriale Variablen werden als absolute und relative Frequenzen (Prozent) angegeben.

Die Normalität von Variablen wird unter Verwendung des Shapiro-Wilk-Tests bewertet. Vergleiche zwischen kategorialen Variablen werden unter Verwendung des Chi-Quadrat-Tests oder des genauen Fisher-Tests durchgeführt.

Unterschiede zwischen quantitativen Variablen werden mit dem T-Test des Schülers oder dem Mann-Whitney-Test getestet.

Präoperative und postoperative klinische Daten, funktionelle Ergebnisse und Bildgebungsergebnisse werden gesammelt und mit histologischen und molekularen Daten korreliert, um potenzielle Biomarker und Prädiktoren für chirurgische Ergebnisse durch lineare Regressionsanalyse zu identifizieren.

Die Korrelation zwischen verschiedenen Parametern wird durch Berechnung des Pearson- und/oder Spearman -Korrelationskoeffizienten weiter bewertet.

Die Ergebnisse werden bei P <0,05 als statistisch signifikant angesehen. Analysen werden mit statistischer Software (R, Cran) durchgeführt.