Proteomisk og histologisk analyse af ligamentum flavum i lændenstenose (APIDeLeG)

Introduktion Lumbal Spinal Stenosis (LSS) er en meget udbredt tilstand over hele verden, der er kendetegnet ved indsnævring af rygmarvskanalen. Epidemiologiske undersøgelser indikerer en høj forekomst af LSS, påvirket af demografiske forskydninger og den stigende byrde af aldersrelaterede muskuloskeletale lidelser. Etiologien af ​​LSS klassificeres primært som erhvervet (degenerativ) eller medfødt, hvilket påvirker ca. 103 millioner individer globalt. Den degenerative form bliver stadig mere almindelig med fremskridende alder. Anatomisk er degenerative LSS opdelt i central, lateral og foraminal stenose, med den højeste forekomst observeret på L4-L5-niveau. De vigtigste etiologiske faktorer inkluderer fortykning og deformation af ligamentum flavum (LF), der ofte er resultatet af reduceret skivehøjde, facetled hypertrofi eller en kombination af begge dele. Blandt disse faktorer anerkendes ligamentum flavum hypertrofi (LFH) som den primære årsag til lændehvirvelsvyggekanalstenose (LSC'er).

LF er en afgørende struktur, der forbinder laminae af tilstødende ryghvirvler, sammensat af ca. 80% elastiske fibre og 20% ​​kollagenfibre. Det spiller en vigtig rolle i dannelsen af ​​den bageste grænse af rygmarvskanalen, hvilket forhindrer overdreven flexion af rygsøjlen og opretholder rygmarvsstabilitet. Flere undersøgelser indikerer, at individer med hypertrofisk LF udviser en reduktion og uorganisering af elastiske fibre, ledsaget af en stigning i kollagenfibre, hvilket antyder, at LFH er drevet af en fibrotisk proces. Identificering af risikofaktorer for LFH forbliver udfordrende og er genstand for løbende debat i litteraturen; Alder og mekanisk stress betragtes i øjeblikket som de mest betydningsfulde bidragydere.

Få undersøgelser har fokuseret på at belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for LSS og LFH eller på at identificere specifikke diagnostiske og prognostiske biomarkører. Som et resultat forbliver patofysiologien og molekylært grundlag for LSS og LFH dårligt forstået, hvilket understreger behovet for præcis molekylær karakterisering og udvikling af målrettede behandlinger baseret på specifikke molekyler.

Zhao et al. identificerede en signifikant stigning i thrombospondin-1 (THBS1) -ekspression i LFH ved anvendelse af proteomik og enkeltcelle-RNA-sekventering i kliniske prøver. Laboratorieeksperimenter demonstrerede, at THBS1 aktiverer SMAD3-signalvejen via transformerende vækstfaktor β1 (TGF-ß1), hvilket forbedrer ekspressionen af ​​fibrotiske markører COL1A2 og α-SMA. En bipedal murin model bekræftede den afgørende rolle af THBS1 i LFH -udvikling. Derudover blev Sestrin2 (SESN2), et stress-responsivt protein, vist at undertrykke THBS1-ekspression, hvilket forhindrede fibrose i LF-celler. Disse fund antyder, at mekanisk overbelastning øger THBS1-produktionen, hvilket udløser TGF-ß1/Smad3-stien og fører til vævshypertrofi. Undertrykkelse af THBS1 -ekspression kunne give en ny terapeutisk tilgang til LFH.

I en anden undersøgelse, Wang et al. fandt, at vildtype amyloid transthyretin (ATTRWT) var til stede i LF-prøver fra patienter, der gennemgik dekompressionskirurgi, med amyloidbelastning positivt korrelerende med LF-tykkelse og lænde LF-byrde på en dosisafhængig måde.

Liu et al. rapporterede, at hypertrofiske LF-prøver udviste højere niveauer af CLU, TGF-ß1, a-SMA, ALK5 og phosphorylerede SMAD3-proteiner sammenlignet med ikke-LFH-prøver. Mekanisk stress og TGF-ß1 viste sig at inducere clusterin (CLU) ekspression i LF-celler. Især inhiberede CLU COL1A2 og a-SMA-ekspression, som blev stimuleret af mekanisk stress og TGF-ß1. Mekaniske undersøgelser demonstrerede, at CLU undertrykte mekanisk stressinduceret og TGF-ß1-drevet SMAD3-aktivitet ved at hæmme Smad3-phosphorylering og nuklear translokation gennem konkurrencedygtig binding med ALK5. Derudover stabiliserede PRKD3 CLU -protein og forhindrede dets lysosomale nedbrydning. In vivo -eksperimenter viste, at CLU -svækket LFH induceret af mekanisk stress. Disse resultater antyder, at CLu mindsker LFH ved at modulere TGF-ß1-signalveje både in vitro og in vivo, der fungerer som en negativ feedbackregulator af TGF-ß1 og inhiberer fibrotiske responser i LF.

Zheng et al. opdagede, at TGF-ß1 signifikant forøgede CRLF1-mRNA-ekspression via Smad3-stien. CRLF1 viste sig at forbedre LF-fibrose gennem ERK-signalvejen på det post-transkriptionelle niveau og var essentiel for de pro-fibrotiske virkninger af TGF-ß1. Når CRLF1 blev tavet, blev fibrose induceret af inflammatoriske cytokiner og mekanisk stress reduceret. Endvidere demonstrerede eksperimenter, at bipedal holdning kunne inducere LFH og øget CRLF1 -ekspression hos mus. Overekspression af CRLF1 førte til LFH in vivo, hvorimod CRLF1 -lyddæmpning forhindrede LFH -udvikling i bipedalmus.

Disse undersøgelser fremhæver den kritiske rolle af specifikke molekyler i udviklingen og reguleringen af ​​LFH. Patogenesen forbliver imidlertid ufuldstændigt belyst. Yderligere forskning er påkrævet for at afklare disse mekanismer og udvikle potentielle strategier til forebyggelse og behandling af LFH og LSS.

Mål og kliniske forsøgsmål (hypotese og forventede resultater) Formålet med denne undersøgelse er at gennemføre en omfattende klinisk og proteomisk undersøgelse af LFH, sammenligne molekylære profiler af forskellige LF-prøver inden for en veldefineret patientkohorte, der opfylder inklusionskriterier og har en statistisk signifikant prøvestørrelse. Proteomics er et værdifuldt værktøj til at studere sygdomme på molekylært niveau, hvilket hjælper med at belyse mekanismer, der er involveret i inflammatoriske responser og biomekanisk stress.

Specifikt fokuserer klinisk proteomik, som anvendt i dette projekt, på den biomedicinske anvendelse af proteomik og integrerer proteomik, epidemiologi, klinisk kemi og medicinske discipliner, der er perfekt tilpasset undersøgelsens mål. Denne fremgangsmåde involverer bestemmelse af den samlede proteinekspressionsprofil for en specifik celle, væv eller kropsvæske på et givet tidspunkt, idet man vurderer kvalitative og kvantitative forskelle mellem sunde og syge individer.

Dette projekt integrerer flere forskningsenheder, hvor klinikere, neurokirurger, biokemikere og molekylære biologer samarbejder nøje for at opnå de ønskede resultater, der hver især bidrager med deres ekspertise til undersøgelsen.

Undersøgelsesdesign

3.1 Undersøgelsestype: Prospektiv observationsundersøgelse af enkeltcenter.

3.2 Undersøgelsesvarighed: Undersøgelsen begynder efter godkendelse fra etikudvalget og vil vare i 36 måneder.

3.3 Undersøgelsesendepunkter

3.3.1 Primært slutpunkt

Undersøg molekylære og histologiske aspekter gennem proteomisk og mikroskopisk analyse for at identificere et potentielt specifikt mønster hos LSS -patienter og sammenligne dem med en sund population.

3.3.2 Sekundære slutpunkter

Korrelere resultaterne af blodprøver (rutinemæssig klinisk blodprøvetagning) med et specifikt LFH -mønster.

Evaluer sammenhænge mellem præoperative billeddannelsesresultater og intraoperative og molekylære resultater.

3.4 Eksperimentelle procedurer

Giv en molekylær karakterisering af ligamentum flavum i to undersøgelsespopulationer (ikke-degenerativ sygdom kontra degenerativ sygdom) gennem anvendelse af en integreret proteomisk tilgang baseret på top-down og bottom-up platforme. Dataene kunne give værdifuld indsigt i de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdommen og progression af sygdommen.

Identificer molekylære biomarkører til kliniske anvendelser: Analysen af ​​forskellige ligamentum -flavumprøver kunne afsløre specifikke proteiner forbundet med rygmarvsstenose og tydeliggøre mekanismerne, der regulerer disse veje. Identificeringen af ​​disse biomarkører kunne forbedre behandlingen af ​​lændehvirvelsøjle -stenose ved at indføre nye terapeutiske mål for at afbøde inflammatoriske og hypertrofiske responser, langsom stenoseprogression og i sidste ende forbedre patienternes livskvalitet.

Dataanalyse og prøvestørrelse

5.1 Prøvestørrelse I betragtning af undersøgelsens art er ikke påkrævet en formel bestemmelse af prøvestørrelse. Baseret på antallet af patienter, der blev behandlet årligt, estimerer vi tilmelding af 100 patienter, der opfylder inkluderings- og ekskluderingskriterierne inden for 24 måneder og beskriver deres proteomiske mønstre. Ligamentum -flavumprøver opnås fra 50 patienter, der gennemgår dekomprimeringskirurgi for lændehvirvelsøjle -stenose og sammenlignet med prøver fra 50 patienter, der gennemgår operation for andre degenerative rygmarvsygdomme.

5.2 Histologisk analyse Prøverne er farvet og undersøgt for at detektere ændringer i sammensætningen af ​​kollagen- og elastinfibre, cellularitet og tilstedeværelsen af ​​inflammatoriske markører. Avancerede billeddannelsesteknikker vil blive anvendt til at kvantificere vævsændringer.

5.3 Molekylær analyse RNA og proteinekstrakter fra ligamentum flavum -prøver vil blive analyseret ved anvendelse af teknikker såsom qPCR, Western blotting og immunohistokemi for at identificere gen- og proteinekspressionsændringer relateret til fibrose, betændelse og ekstracellulær matrix ombygning.

5.4 Proteomiske analyse Ligamentprøver gennemgår proteomisk analyse ved anvendelse af massespektrometri-platforme ved anvendelse af integrerede top-down og bottom-up-tilgange.

5.5 Statistiske analyse Kvantitative variabler efter en normal fordeling opsummeres som gennemsnit og standardafvigelse (SD) eller ellers som median og interkvartil rækkevidde (IQR).

Kategoriske variabler rapporteres som absolutte og relative frekvenser (procentdel).

Normaliteten af ​​variabler vurderes ved hjælp af Shapiro-Wilk-testen. Sammenligninger mellem kategoriske variabler udføres ved hjælp af chi-square-testen eller Fishers nøjagtige test.

Forskelle mellem kvantitative variabler testes ved hjælp af Students t-test eller Mann-Whitney-testen.

Preoperative og postoperative kliniske data, funktionelle resultater og billeddannelsesresultater vil blive indsamlet og korreleret med histologiske og molekylære data for at identificere potentielle biomarkører og forudsigere for kirurgiske resultater gennem lineær regressionsanalyse.

Korrelation mellem forskellige parametre evalueres yderligere ved beregning af Pearson og/eller Spearman -korrelationskoefficienten.

Resultaterne vil blive betragtet som statistisk signifikante ved P <0,05. Analyser udføres ved hjælp af R Statistical Software (R, Cran).