Analisi proteomica e istologica del ligamentum flavum nella stenosi lombare (APIDeLeG)

Introduzione La stenosi spinale lombare (LSS) è una condizione altamente diffusa in tutto il mondo, caratterizzata dal restringimento del canale spinale. Studi epidemiologici indicano un'alta incidenza di LSS, influenzata dai cambiamenti demografici e dal crescente onere dei disturbi muscoloscheletrici legati all'età. L'eziologia dell'LSS è principalmente classificata come acquisita (degenerativa) o congenita, che colpisce circa 103 milioni di individui a livello globale. La forma degenerativa diventa sempre più comune con l'avanzare dell'età. Anatomicamente, LSS degenerativo è suddiviso nella stenosi centrale, laterale e foraminale, con la più alta prevalenza osservata a livello di L4-L5. I principali fattori eziologici includono ispessimento e deformazione del ligamentum flavum (LF), spesso derivante da un'altezza del disco ridotta, dall'ipertrofia dell'articolazione delle faccette o da una combinazione di entrambi. Tra questi fattori, l'ipertrofia del ligamentum flavum (LFH) è riconosciuta come la causa principale della stenosi del canale spinale lombare (LSC).

L'LF è una struttura cruciale che collega le lamine delle vertebre adiacenti, composta da circa l'80% di fibre elastiche e fibre di collagene al 20%. Ha un ruolo vitale nel formare il limite posteriore del canale spinale, prevenendo una flessione eccessiva della colonna vertebrale e mantenendo la stabilità spinale. Diversi studi indicano che gli individui con LF ipertrofico presentano una riduzione e disorganizzazione delle fibre elastiche, accompagnate da un aumento delle fibre di collagene, suggerendo che LFH è guidato da un processo fibrotico. L'identificazione dei fattori di rischio per LFH rimane impegnativo ed è oggetto di dibattito in corso in letteratura; L'età e lo stress meccanico sono attualmente considerati i contributori più significativi.

Pochi studi si sono concentrati sulla chiacchierata dei meccanismi molecolari alla base di LSS e LFH o sull'identificazione di specifici biomarcatori diagnostici e prognostici. Di conseguenza, la patofisiologia e le basi molecolari di LSS e LFH rimangono scarsamente comprese, sottolineando la necessità di una caratterizzazione molecolare precisa e lo sviluppo di trattamenti mirati basati su molecole specifiche.

Zhao et al. ha identificato un aumento significativo dell'espressione della trombospondina-1 (THBS1) in LFH usando la proteomica e il sequenziamento dell'RNA a cellula singola in campioni clinici. Gli esperimenti di laboratorio hanno dimostrato che THBS1 attiva la via di segnalazione Smad3 trasformando il fattore di crescita β1 (TGF-β1), migliorando l'espressione dei marcatori fibrotici COL1A2 e α-SMA. Un modello murino bipede ha confermato il ruolo cruciale di THBS1 nello sviluppo di LFH. Inoltre, Sestrin2 (SESN2), una proteina sensibile allo stress, ha dimostrato di sopprimere l'espressione di THBS1, prevenendo la fibrosi nelle cellule LF. Questi risultati suggeriscono che il sovraccarico meccanico aumenta la produzione di THBS1, innescando la via TGF-β1/Smad3 e portando all'ipertrofia tissutale. La soppressione dell'espressione di THBS1 potrebbe fornire un nuovo approccio terapeutico per LFH.

In un altro studio, Wang et al. ha scoperto che la trantiretina amiloide di tipo selvaggio (ATTRWT) era presente nei campioni di LF di pazienti sottoposti a chirurgia di decompressione, con carico amiloide correlato positivamente con lo spessore LF e il carico lombare LF in modo dose-dipendente.

Liu et al. ha riferito che i campioni di LF ipertrofici hanno mostrato livelli più elevati di proteine ​​SMAD3 CLU, TGF-β1, α-SMA, ALK5 e fosforilate rispetto ai campioni non LFH. È stato scoperto che lo stress meccanico e il TGF-β1 inducono l'espressione della clusterina (Clu) nelle cellule LF. In particolare, la CLU ha inibito l'espressione di COL1A2 e α-SMA, che sono state stimolate dallo stress meccanico e dal TGF-β1. Studi meccanicistici hanno dimostrato che CLU ha soppresso l'attività di Smad3 indotta da stress meccanico e guidato dal TGF-β1 inibendo la fosforilazione di Smad3 e la traslocazione nucleare attraverso il legame competitivo con ALK5. Inoltre, la PRKD3 ha stabilizzato la proteina CLU, prevenendo la sua degradazione lisosomiale. Gli esperimenti in vivo hanno mostrato che CLU ha attenuato LFH indotto dalla sollecitazione meccanica. Questi risultati suggeriscono che Clu mitiga LFH modulando le vie di segnalazione TGF-β1 sia in vitro che in vivo, agendo come regolatore di feedback negativo di TGF-β1 e inibendo le risposte fibrotiche in LF.

Zheng et al. ha scoperto che il TGF-β1 ha aumentato significativamente l'espressione dell'mRNA di CRLF1 attraverso la via Smad3. È stato scoperto che CRLF1 migliora la fibrosi LF attraverso la via di segnalazione ERK a livello post-trascrizionale ed era essenziale per gli effetti pro-fibrotici di TGF-β1. Quando CRLF1 è stato messo a tacere, la fibrosi indotta da citochine infiammatorie e lo stress meccanico è stata ridotta. Inoltre, gli esperimenti hanno dimostrato che la postura bipede potrebbe indurre LFH e aumentare l'espressione di CRLF1 nei topi. La sovraespressione di CRLF1 ha portato a LFH in vivo, mentre il silenziamento CRLF1 ha impedito lo sviluppo di LFH nei topi bipedi.

Questi studi evidenziano il ruolo critico delle molecole specifiche nello sviluppo e nella regolazione di LFH. Tuttavia, la patogenesi rimane incompleta. Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire questi meccanismi e sviluppare potenziali strategie per la prevenzione e il trattamento di LFH e LSS.

Obiettivi e obiettivi di sperimentazione clinica (ipotesi e risultati attesi) L'obiettivo di questo studio è di condurre un'indagine clinica e proteomica completa di LFH, confrontando i profili molecolari di diversi campioni di LF all'interno di una coorte di pazienti ben definita che soddisfa i criteri di inclusione e ha una dimensione statisticamente significativa del campione. La proteomica è uno strumento prezioso per studiare le malattie a livello molecolare, contribuendo a chiarire i meccanismi coinvolti nelle risposte infiammatorie e nello stress biomeccanico.

In particolare, la proteomica clinica, applicata in questo progetto, si concentra sull'applicazione biomedica della proteomica e integra la proteomica, l'epidemiologia, la chimica clinica e le discipline mediche, allineandosi perfettamente con gli obiettivi dello studio. Questo approccio prevede la determinazione del profilo totale di espressione proteica di una cellula, del tessuto o del fluido corporeo specifico in un determinato momento, valutando le differenze qualitative e quantitative tra soggetti sani e malati.

Questo progetto integra più unità di ricerca, in cui clinici, neurochirurghi, biochimici e biologi molecolari collaborano da vicino per raggiungere i risultati desiderati, ciascuno che contribuisce con le loro competenze allo studio.

Progettazione dello studio

3.1 Tipo di studio: studio osservazionale prospettico a centro singolo.

3.2 Durata dello studio: lo studio inizierà in seguito all'approvazione del comitato etico e durerà per 36 mesi.

3.3 Endpoint di studio

3.3.1 Endpoint primario

Studia aspetti molecolari e istologici attraverso l'analisi proteomica e microscopica per identificare un potenziale modello specifico nei pazienti con LSS, confrontandoli con una popolazione sana.

3.3.2 Endpoint secondari

Risultati degli esami del sangue correlati (campionamento di sangue clinico di routine) con un modello LFH specifico.

Valutare le correlazioni tra risultati di imaging preoperatorio e risultati intraoperatori e molecolari.

3.4 Procedure sperimentali

Fornire una caratterizzazione molecolare del ligamentum flavum in due popolazioni di studio (malattia non degenerativa vs. malattia degenerativa) attraverso l'applicazione di un approccio proteomico integrato basato su piattaforme top-down e bottom-up. I dati potrebbero fornire preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base dell'insorgenza e della progressione della malattia.

Identificare i biomarcatori molecolari per applicazioni cliniche: l'analisi di diversi campioni di ligamentum flavum potrebbe rivelare proteine ​​specifiche associate alla stenosi spinale e chiarire i meccanismi che regolano questi percorsi. L'identificazione di questi biomarcatori potrebbe migliorare significativamente il trattamento della stenosi spinale lombare introducendo nuovi obiettivi terapeutici per mitigare le risposte infiammatorie e ipertrofiche, la lenta progressione della stenosi e, in definitiva, migliorare la qualità della vita dei pazienti.

Analisi dei dati e dimensione del campione

5.1 Dimensione del campione data la natura dello studio, non è richiesta una determinazione formale della dimensione del campione. Sulla base del numero di pazienti trattati ogni anno, stimiamo iscrizione a 100 pazienti che soddisfano i criteri di inclusione ed esclusione entro 24 mesi e descrivendo i loro modelli proteomici. I campioni di ligamentum flavum saranno ottenuti da 50 pazienti sottoposti a chirurgia di decompressione per stenosi spinale lombare e confrontati con campioni di 50 pazienti sottoposti a chirurgia per altre malattie spinali degenerative.

5.2 Analisi istologica I campioni verranno colorati ed esaminati per rilevare i cambiamenti nella composizione delle fibre di collagene ed elastina, cellularità e presenza di marcatori infiammatori. Verranno impiegate tecniche di imaging avanzate per quantificare le alterazioni dei tessuti.

5.3 Analisi molecolare RNA e estratti di proteine ​​da campioni di ligamentum flavum saranno analizzati usando tecniche come qPCR, blotting occidentale e immunoistochimica per identificare i cambiamenti di espressione genica e proteica legati alla fibrosi, infiammazione e rimodellamento della matrice extracellulare.

5.4 I campioni di legamento di analisi proteomica subiranno analisi proteomiche utilizzando piattaforme di spettrometria di massa, impiegando approcci dall'alto verso il basso e dal basso verso l'alto.

5.5 Analisi statistica Le variabili quantitative a seguito di una distribuzione normale saranno riassunte come deviazione media e standard (SD) o, altrimenti, come intervallo mediano e interquartile (IQR).

Le variabili categoriche saranno riportate come frequenze assolute e relative (percentuale).

La normalità delle variabili verrà valutata usando il test Shapiro-Wilk. I confronti tra variabili categoriali verranno eseguiti utilizzando il test Chi-quadrato o il test esatto di Fisher.

Le differenze tra variabili quantitative saranno testate usando il test t di Student o il test di Mann-Whitney.

I dati clinici preoperatori e postoperatori, i risultati funzionali e i risultati di imaging saranno raccolti e correlati con dati istologici e molecolari per identificare potenziali biomarcatori e predittori di risultati chirurgici attraverso l'analisi della regressione lineare.

La correlazione tra vari parametri verrà ulteriormente valutata calcolando il coefficiente di correlazione di Pearson e/o Spearman.

I risultati saranno considerati statisticamente significativi a p <0,05. Le analisi saranno condotte utilizzando il software statistico R (R, Cran).