Differentiel genekspression af levervæv og blod fra personer med kronisk viral hepatitis

Formålet med denne undersøgelse er at identificere gener, der er specifikt op- eller nedreguleret i kronisk viral hepatitis og autoimmun leversygdom og derefter at undersøge, hvordan disse ekspressionsmønstre relaterer sig (hvis overhovedet) til kliniske resultater. Ekspressionsmønsteret af tusindvis af gener skulle give ekstremt kraftfulde statistiske værktøjer til at skelne mellem forskellige patofysiologiske tilstande. Det er velkendt, at hverken hepatitis B eller hepatitis C er direkte cytotoksisk, deres virkning ser ud til at være medieret via et immunrespons. Tilsvarende hos personer med autoimmun leversygdom, f.eks. primær biliær cirrhose (PBC), primær skleroserende cholangitis (PSC) og autoimmun hepatitis (AIH) immunmedierede mekanismer ser ud til at være årsagen til deres leversygdom, selvom det/de fremkaldende antigen(er) forbliver ukendte. Mønstret for genekspression kan give fingerpeg om både årsagen og patogenesen af ​​sygdommen. For eksempel, hvis en sygdom er forårsaget af en infektion, observeres et specifikt cytokinrespons, som vil være anderledes, hvis denne infektion er viral eller bakteriel eller parasitisk. Det er også muligt, at et vist mønster af respons ville blive fremkaldt, hvis sygdommen er forårsaget som en reaktion på xenobiotika. Hos patienter med autoimmun leversygdom er det muligt, at et endogent og/eller et eksogent antigen initierer sygdommen med en efterfølgende autoimmun respons. Endelig er det også muligt, at en helt uventet række af cellulære hændelser er ansvarlige for patogenesen, og mikroarray-eksperimenterne vil gøre os i stand til at opdage disse processer.

HCV - Den molekylære genetik af hepatitis C virusinfektion HCV molekylærbiologi: HCV er et positivt-strenget RNA Flaviviridae virus med et 9,6 kB genom. Genomet koder for et polyprotein på ca. 3000 aminosyrer, som efterfølgende spaltes af værts- og virusspecifikke proteaser for at give 4 strukturelle og 6 ikke-strukturelle polypeptider. De 4 funktionelle proteiner inkluderer en metalloproteinase (NS5A), serinprotease (NS3/NS4A), RNA-helicase (NS3) og en RNA-afhængig RNA-polymerase (NS5B). Seks forskellige genotyper af HCV er blevet beskrevet, hvor genotype 1 er den mest udbredte på verdensplan og genotype 4 er den mest udbredte i Mellemøsten.

De forskellige genotyper interagerer forskelligt med værtens immunsystem, selvom det molekylære grundlag for dette er uklart. Kronisk infektion med genotype 1 og 4 er notorisk resistent over for behandling med IFN, mens genotype 2 og 3 har relativt bedre respons. Denne forskel kan til dels skyldes mutationer i NS5A-proteinet. I cellulære modeller kan NS5A interagere med IFN-inducerede antivirale enzymer såsom 2'5'OAS. Andre HCV-proteiner interagerer sandsynligvis med cellulære proteiner for at ændre respons på immun- og IFN-antivirale mekanismer: HCV-kerneprotein dæmper lymfocytiske Th1-responser og påvirker IRF-, Jak/STAT- og iNOS-veje. Selvom disse resultater antyder, hvordan virussen kan ændre kendte cellulære veje, er virusunddragelse af immunsystemet multifaktoriel og klart kompleks.

Forskningshypotese: De processer, der fører til vedvarende akut HCV-infektion, er på molekylært niveau relateret til dem, der driver HCV-resistens over for IFN-terapi. At belyse det specifikke værts/virale respons i begge disse sammenhænge vil give nye mål for små-molekyle antiviral terapi, som kan anvendes både til akut og kronisk HCV.

Fremskridtsrapport: CIHR 106800 Vi har etableret et stort og voksende vævs- og RNA-register til undersøgelse af leversygdomme og har udført en omfattende genarray-analyse af kronisk HCV. Nogle af vores vigtigste resultater er detaljeret her.

HCV er en kompleks og fremadskridende sygdom, hvor interaktionen mellem vært og virus har dybtgående virkninger. Kombinationen af ​​klinisk og eksperimentel variabilitet kan alvorligt forvirre resultaterne af en genekspressionsundersøgelse og kræver, at et stort antal patienter og prøver undersøges. At leverpatologi kan være ens blandt en række forskellige sygdomme, nødvendiggør også, at mange forskellige patienter og sygdomme indgår i analysen. Derfor har vi analyseret et stort antal patienter og kontroller og har vedligeholdt omhyggelige databaser med kliniske detaljer for at udføre multivariate analyser af genarray-dataene. På nuværende tidspunkt har vi brugt et 19K humant mikroarray til at bestemme hepatisk genekspression hos 86 HCV-patienter og har sammenlignet disse med 24 normale, 20 HBV- og 14 PBC-patienter. Array-dataene er af høj kvalitet: Vores bekræftelsesrater ved PCR i realtid overstiger 80 %. Vi har nu undersøgt de relative bidrag af alder, køn, viral genotype (1 vs 2/3), grad af fibrose og sygdomsaktivitet på de gener, der er mest opreguleret af infektion med HCV. Den vigtigste determinant for konsistente genekspressionsprofiler i HCV-inficerede lever er viral genotype (genotype 1 vs. alle andre). Inden for Genotype 1-prøver er der imidlertid en klar forskel i genekspression.

Denne divergerende vært-virus-interaktion afspejles i den efterfølgende respons på PegIFN/Rib-terapi. Alle de HCV-leverbiopsier, vi har analyseret til dato, blev taget fra patienter, der gik videre til behandling med PegIFN/Rib. På nuværende tidspunkt er behandlingen afsluttet hos 49 af disse patienter. I en observation, der kan have betydelig klinisk nytte, viste vi, at det ultimative respons på behandling (vedvarende viral respons versus non-responder/relapser) blev afspejlet i de originale genekspressionsprofiler. Vi identificerede 18 gener, hvis ekspressionsniveauer adskilte respondere fra ikke-respondere/relapsere med en nøjagtighed på >90 %. Baseret på denne observation indgav vi et patent for at beskytte den intellektuelle ejendomsret og dannede et selskab til at kommercialisere den genetiske test. Resultaterne er også sendt til offentliggørelse. Tilsammen mener vi, at vi har beskrevet et sæt gener, eller måske en biologisk proces, der ligger i hjertet af vært-HCV-interaktionen.

Afsnit I. En mulig rolle for UBP43, ISG15-vejen i HCV-interferonet Mens vores genekspressionsprofiler har skelnet mellem to typer af kronisk HCV-infektion - den ene, der reagerer på IFN, og den anden, der ikke gør - er vores hovedmål at opnå en molekylær forståelse af rollerne af specifikke gener og proteiner i værtens respons på HCV. Selvom et ændret genekspressionsniveau ikke direkte implicerer genproduktet i den biologiske vej, er der overbevisende biologiske grunde til at antyde, at i det mindste nogle af generne på vores liste spiller en vigtig rolle i virale-IFN-responser. Flere af de mest opregulerede gener er interferonfølsomme (inklusive OAS, Mx1, ISG15, VIPERIN, IFIT og GIP2). Polymorfier af OAS har været svagt forbundet med selvbegrænset HCV-infektion, og polymorfier af Mx1 har været svagt forbundet med responsstatus. Hepatiske mRNA-niveauer for OAS, Mx1 og GIP2 er øget ved kronisk HCV, men ingen, alene, er blevet forbundet med behandlingsresultatet. De gener, der ikke er direkte IFN-responsive, kan spille roller i cellulære veje, der er vigtige for IFN-responser (PI3AP1, DUSP1), og er involveret i inflammatorisk celleaktivering og -modning (LAP).

ISG15 og UBP43/USP18, som er komponenter i en nyligt anerkendt IFN regulatorisk pathway, er måske den mest interessante undergruppe af gener, der blev fundet at være differentielt udtrykt i vores undersøgelser. Begge gener udtrykkes mere højt i non-responder (NR) sammenlignet med responder (R) levervæv, hvilket tyder på, at de kan interferere med immunresponset i HCV-inficeret lever. ISG15 er et ubiquitin-lignende (Ubl) protein, som menes at være vigtigt til medfødte immunfunktioner og er kovalent forbundet med proteiner efter interferonaktivering. Hvordan dette link opnås, er kontroversielt og kan involvere en vis overlapning med kendte E2 Ub-enzymer. Interessant nok blev E2 Ub-enzymet UBCH8 for nylig identificeret som en aktivator af ISG15,34 og er et af generne opreguleret som reaktion på kronisk HCV i vores mikroarray-analyse. Konjugationen af ​​ISG15 til dets målproteiner vendes af en meget specifik protease, USP18/UBP43. UBP43 tilhører en familie af Ub-specifikke proteaser og induceres af IFN, LPS og virusinfektion; den nedbrydes af Skp2 Ub-ligasen. Tab af USP18 i mus fører til IFN-overfølsomhed. Vores data forbinder UBP43 med HCV og antyder, at vejen er vigtig i en divergerende vært/viral respons.

Forskningsmål I. At fastslå rollerne for de 18 gener - især af ISG15 og UBP43 - forbundet med en divergerende vært/virus-interaktion ved hjælp af en HCV-replikonmodel.

Forskningsprotokoller for sektion I:

DNA-mikroarray-undersøgelser kaster lys over cellens transkriptionstilstand, men forbinder ikke nødvendigvis specifikke genprodukter med det biologiske problem, der behandles. Derfor er det vigtigt at teste rollerne af individuelle gener ved hjælp af andre tilgange. Vi vil bruge in vitro-assays af viral replikation til at studere rollerne af gener, hvis ekspression vi har fundet at være ændret i HCV-inficeret lever. Disse er ikke ligetil eksperimenter, da HCV er en svær virus at studere. HCV replikerer kun i mennesker og chimpanser og kun dårligt i isolerede humane perifere blodceller, selvom disse fungerer som en ekstrahepatisk viral pool. Subgenomiske RNA-replikoner kan transficeres ind i visse cellelinjer og vedligeholdes, men til dato er kun nogle få genotyper med succes blevet oversat til en replikonmodel (1b, 1a og 2a). For nylig blev en elegant HCV-model beskrevet i Edmonton, hvor humane hepatocytter transplanteres ind i SCID-beige mus. Denne model understøtter HCV-infektion og replikation; men da hovedparten af ​​HCV-effekter skyldes immunresponset, der genereres af virussen, er denne model, som den eksisterer i øjeblikket, muligvis ikke ideel til at studere, hvordan virussen fører til leverskade og undgår antivirale immunresponser hos mennesker.

Vi har valgt at udforske rollen af ​​vores gener af interesse ved hjælp af fuldlængde HCV genotype 1a replikon assay, i samarbejde med Dr. Charles Rice (Rockefeller University, New York). Dette replikon er en variant af fuldlængde HCV H77-stammen beskrevet for nylig af Dr. Rice, men har højere replikationsniveauer i cellekultur end den tidligere version. Replikonmodellen er ideel til hurtigt at teste virkningerne af mange gener og er blevet brugt flittigt til at studere HCV-mekanismer på cellulært niveau. Denne tilgang vil blive brugt til alle de gener, der er identificeret som af potentiel interesse i undersøgelserne ovenfor, med fokus først på ISG15- og UBP43-generne, dernæst på de 16 gener, der er tilbage på vores responsdiskriminerende liste, og til sidst på nye gener identificeret i genekspressionsundersøgelser beskrevet nedenfor.

Ia. Effekt af siRNA-knockdown og opregulering (transfektion) af individuelle gener, herunder UBP43 og ISG15, på HCV-replikon i Huh7.5-celler.

Vi vil bruge RNA-interferens (RNAi) til at "slå ned" specifikke gener for at evaluere deres roller på viral replikation. Små dobbeltstrengede RNA-molekyler vil blive brugt til at inducere sekvensspecifik nedbrydning af homolog enkeltstrenget RNA. For de fleste af disse undersøgelser vil lager Huh7.5-celler blive sammenlignet med Huh7.5-celler, der stabilt udtrykker fuldlængde Genotype 1a HCV-replikon udviklet i Dr. Charles Rices laboratorium. Metoden beskrevet nedenfor er rutine i vores laboratorium og vores samarbejdspartneres laboratorier.

Kontrolundersøgelser: Baseline gen og proteinekspression, effekt af IFN, effekt af replikon:

Replikonsystemet kan ikke kun bruges til at teste virkningen af ​​et givet gen på viral replikation, men også for virkningerne på IFN-responset. Tidligere undersøgelser har vist, at HCV 1b genotype RNA replikation er følsom over for IFN-a behandling, selv ved lave doser. Faktisk er rollerne for to af generne på vores liste over atten, MxA og GIP3/IFI6-16, allerede blevet undersøgt. IFN-hæmningen af ​​HCV 1b-replikon-RNA-replikation er uafhængig af MxA, og forbigående transfektion af GIP3 inhiberer ikke i sig selv 1b-replikonet, men forstærker effekten af ​​IFNa. Vi vil nu studere rollerne for de resterende gener på vores liste ved hjælp af HCV genotype 1a replikon. Undersøgelserne beskrevet nedenfor skitserer vores tilgang til ISG15- og UBP43-generne; lignende strategier vil imidlertid blive anvendt for de andre gener af interesse.

Huh7.5-celler og HCV-replikonceller vil blive inkuberet i 12 timer med stigende doser af IFNa2b (0, 1,10 og 100U/ml), IFNb (0,10,100 og 1000 U/ml) eller IFNg (0,10,100 og 1000 U/ml), og ISG 15, UBP43 og HCV mRNA-niveauer bestemt ved real-time PCR. ISG15-proteinniveauer vil blive bestemt ved western blot (mAb den venlige gave fra Dr. E.C. Borden, Scripps Institute); UBP43 western-undersøgelser vil blive udført, efter at vi har skabt antistoffer, eller når antistoffet bliver tilgængeligt (i øjeblikket udvikles det i laboratoriet hos Dr. D.E. Zhang, Scripps Institute). RNA-isolering vil blive udført ved standard Trizol-ekstraktion og proteinekstraktion ved at lysere cellerne i RIPA-buffer. Disse undersøgelser vil etablere mRNA- og proteinniveauer for ISG15 og UBP43 ved baseline og som respons på IFN, replicon og replicon/IFN.

Et vigtigt spørgsmål er at bekræfte, at genet eller proteinet af interesse er udtrykt i disse celler før knock-down eksperimenterne. I foreløbige undersøgelser har vi fastslået, at der er basislinjeekspression af både ISG15 og UBP43 mRNA i både Huh7.5 og replikonceller (real-time PCR), og at IFNa kraftigt inducerer proteinekspression af ISG15 i Huh7.5 celler. Disse resultater argumenterer for, at ISG15- og UBP43-vejen er relevant for denne model.

siRNA undersøgelser: Vi antager, at eliminering af UBP43 vil føre til mindre HCV RNA replikation ved baseline og vil forstørre effekten af ​​IFN, og at eliminering af ISG15 vil øge baseline HCV RNA og mindske effekten af ​​IFN. Silencing og kontrol siRNA'er vil blive opnået fra Ambion. Disse vil blive transficeret med GenePorter i henhold til producentens instruktioner; transfektionsbetingelser vil blive optimeret ved hjælp af SV40-promotor/enhancer luciferase-kontrolplasmidet, pGL2-kontrol, for at sikre, at stigende mængder af skabeloner resulterer i proportionale stigninger i luciferaseaktivitet. Otteogfyrre timer efter transfektionen vil samlede RNA- eller proteinprøver blive forberedt som før. Real-time PCR vil blive udført for at bestemme mRNA-ekspression i nærvær eller fravær af siRNA, og proteinniveauer vil blive bestemt ved Western blot. Efter at disse kontrolundersøgelser er blevet udført, vil effekten af ​​siRNA-hæmning på baseline og IFN-behandlet HCV RNA-replikation blive testet.

Transfektionsundersøgelser:

Vi antager, at opregulering af UBP43 vil øge in vitro HCV RNA replikation ved baseline og vil mindske effekten af ​​IFN, og at opregulering af ISG15 vil reducere baseline HCV RNA og øge effekten af ​​IFN. UBP43-ekspression vil blive opreguleret under anvendelse af et UBP43-ekspressionsplasmid pcDNA6-UBP43; ISG15-ekspressionsplasmid vil blive opnået ved at subklone ISG15-genet i pcDNA6-vektor. Som før vil HCV RNA-niveauer blive bestemt i nærvær og fravær af IFNa ved anvendelse af real-time PCR.

Tilsammen vil disse undersøgelser definere rollerne for de gener, der foreslås at spille en vigtig rolle i skelnen mellem kliniske PegIFN/Rib-behandlingsrespondere og ikke-respondere.

Ib. Virkningsmekanisme for ISG15/UBP43-vejen:

Hvis vi bestemmer, at ISG15 og UBP43 spiller en rolle i HCV RNA-replikation i genotype 1-replikonmodellen, vil vi undersøge, hvordan denne effekt medieres. Vi vil afgøre, om effekten af ​​UBP43 er afhængig af dets proteasefunktion eller af dets association med et andet cellulært protein. Vi vil også identificere, hvilke ISG15-proteinmål, der kan mediere dens effekt.

Rolle af UBP43 protease aktivitet:

Hvis eliminering af UBP43 viser sig at reducere viral replikation eller forstørre interferon-responset, antager vi, at inhibering af UBP43 vil repræsentere et nyt middel til behandling af HCV. UBP43 ville være af særlig interesse, fordi det har proteaseaktivitet: proteaser er kendte og validerede mål for små molekyle terapier. Det ville således være kritisk at fastslå, om proteaseaktiviteten af ​​UBP43 er vigtig for dens virkning på HCV-replikation, og ikke for eksempel dens interaktion med et andet cellulært protein. For at løse dette spørgsmål vil vi overudtrykke UBP43-protease-inaktive konstruktioner. En inaktiv form af UBP43 vil blive dannet ved mutation af en kritisk cysteinrest (Cys61) til serin ved anvendelse af stedrettet mutagenese af pBK/CMV-UBP43-plasmid som beskrevet tidligere. For at karakterisere de proteaseaktive og inaktive former af UBP43, vil vildtype og mutant UBP43 blive udtrykt som GST-fusionsproteiner i ekspressionsvektoren pGEX-4T-3 (pGEX-4T-3-UBP43) og transformeret til E. Coli BL21 (DE3) med et plasmid, pET-ISG15-UBP43-H, der udtrykker ISG15-UBP43 fusionsprotein.35 ISG15-spaltning fra fusionsproteinet vil blive vist ved Western blot. Når vi har bekræftet, at proteasefunktionen er elimineret ved sted-rettet mutagenese, vil vildtype og muteret UBP43 blive overudtrykt i Huh7.5-celler med HCV-replikonet og udsat for stigende doser af IFNa. Hvis proteasefunktionen er kritisk, vil overekspression af den inaktive (på en dominerende negativ måde) øge reaktionsevnen over for IFN.

Proteinmål for ISG15:

Tidligere arbejde med thymusvæv har identificeret flere mål for ISGylering ved ISG15, herunder phospholipase Cg1, Jak1 og ERK1. Hvorvidt disse er mål i Huh7.5-celler vides ikke, selvom ERK og JAK tidligere har været forbundet med antivirale effekter i HCV-replikonmodellen. Hvis vi finder ud af, at ISG15 er impliceret i HCV-replikation, vil vi søge at identificere substrater for ISG15-modifikation. Vi vil først udføre en række immunfældningsundersøgelser rettet specifikt mod de proteiner, der tidligere har vist sig at være modificeret af ISG15, og udforske forskellene mellem inficerede og uinficerede celler. Kort fortalt, efter inkubation af Huh7.5-celler +/- replikon med IFNa i 12 timer, vil celler blive lyseret i RIPA-buffer og immunpræcipitation af ISG15-konjugater udført med anti-ISG15-mAb'et anvendt ovenfor. Efter opløsning på en reducerende gel vil der blive udført western blots for at bestemme, om de tre mål ovenfor er konjugeret af ISG15, ved hjælp af kommercielt tilgængelige mAbs. Hvis nogen eller alle målene er konjugeret, vil der blive udført yderligere undersøgelser for at belyse konsekvenserne af ISGylering.

For mere fuldstændigt at udforske, hvilke proteiner der er modificeret med ISG15 i cellekultur, vil vi foretage en mere omfattende screening ved hjælp af massespektroskopi - ved at anvende en strategi, der tidligere blev brugt til at identificere mål for det ubiquitin-lignende SUMO-protein. TAP-tagging-tilgange kombineret med MALDI-TOF massespektrometri vil blive brugt. Vi vil transficere celler med TAP-mærket eller SPA-mærket ISG15 og oprense protein- og proteinkomplekserne fra celler behandlet eller ubehandlet med IFN. Ved hjælp af etablerede procedurer vil vi derefter oprense og identificere substraterne ved hjælp af gelelektroforese og massespektrometri. Gelskiver indeholdende proteinerne vil blive reduktivt alkyleret og udsat for trypsinolyse. Peptiderne vil blive oprenset og analyseret ved MALDI-TOF massespektrometri ved anvendelse af en cyano-4-hydroxycin-namic acid matrix på et Voyager DE-STR instrument (Applied Biosystems). Identifikation af proteinerne ved hjælp af disse massefingeraftryksdata vil blive udført ved hjælp af ProFound-softwaren. Da MS ikke kan bruges til at kvantificere proteinmængder, vil vi identificere proteiner af interesse ved at sammenligne lister over proteiner ISGyleret under de forskellige forhold og derefter udføre Western blot-undersøgelser for at sammenligne proteinmængder. Når vi udfører disse eksperimenter, vil vi bruge MS-udstyret og den ekspertise, der er let tilgængelig på Best Institute.

Konklusioner I: Tilsammen vil disse undersøgelser klart definere rollerne af ISG15- og UBP43-vejen i HCV-replikonresponset på IFN og vil foreslå, hvordan effekten medieres. Det er vigtigt, at de ovenfor beskrevne metoder, selvom de er detaljerede for ISG15 og UBP43, er generiske og kan anvendes på andre kandidatgener af interesse.

Afsnit II: Genekspressionsprofilering af akut hepatitis C viral infektion:

Der er ligheder i de veje, som vi har identificeret som vigtige i den kroniske sygdom, med dem, der kan være vigtige ved akut infektion. For eksempel ændrer polymorfismer af 2'5'OAS - et gen fundet på vores liste - risikoen for at udvikle sig fra akut til kronisk infektion.20 Derfor antager vi, at det samme sæt af gener sandsynligvis vil spille en vigtig rolle i at bestemme, om man ikke klarer akut infektion. Vi vil teste denne hypotese ved hjælp af mikroarray-analyse.

Vi planlægger at undersøge rollen af ​​disse og andre gener i akut HCV-infektion i både den systemiske og lokale vært/virus-interaktion. Akut inficeret levervæv er svært at opnå, fordi de fleste akutte HCV-infektioner ikke identificeres, og fordi det er uhensigtsmæssigt at udføre leverbiopsier i disse tilfælde. Vi vil derfor bruge to forskellige tilgange. Først vil vi studere genekspressionsmønstrene i perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) indsamlet fra egyptiske sundhedsarbejdere med akut HCV (leveret af Dr. Sanaa Kamal) og sammenligne disse med PBMC'er fra patienter med genotype-matchede kronisk HCV og til raske frivillige. Vi vil udvikle prædiktive modeller for at teste, hvilke genundersæt der er mest forbundet med kliniske resultater, såsom etablering af kronisk infektion. For det andet vil vi bruge tilbagefald af HCV efter transplantation som en model for akut hepatitis in vivo. Vi vil tage biopsier af donorleveren FØR transplantation og derefter følge genekspressionsniveauer over tid, efterhånden som virussen inficerer transplantatet. Efter transplantation bliver den HCV-naive lever hurtigt og universelt inficeret med HCV, selvom kun 70% af patienterne udvikler histologiske tegn på recidiv på leverbiopsier taget 3 og/eller 6 måneder efter transplantationen. Det er disse patienter, som vi i øjeblikket behandler for tilbagevendende HCV ved hjælp af PegIFN/Rib. Som før vil vi udvikle prædiktive modeller til at associere genundergrupper med kliniske resultater. Vi har opnået mere end 60 % svarprocent ved at tilskynde til behandlingsadhærens på trods af de endnu mere opslidende bivirkninger efter transplantation. Hvad angår behandlingen af ​​HCV før transplantation, reagerer en betydelig del af patienterne således ikke på terapi og udsættes unødvendigt for sygelige bivirkninger: Det centrale kliniske resultat, vi vil overveje, er respons på terapi med PegIFN/Rib. Et andet resultat af interesse er den hurtige udvikling af skrumpelever inden for 5 år hos 25-30 % af patienterne og udviklingen af ​​en aggressiv fibroserende kolestatisk tilstand hos 7-9 % inden for 2 år efter transplantationen. Tilsammen vil disse data pege på de gener, der er vigtige for den immunologiske respons, der resulterer i sygdomspersistens eller eliminering (akut HCV hos sundhedspersonale) og progression af leversygdom (post-transplantationspatienter). Meget op- og nedregulerede gener vil blive yderligere undersøgt i HCV-replikonmodellen.

Forskningsmål 2. At bestemme de genekspressionsprofiler, der er mest forbundet med kliniske resultater ved akut hepatitis, både i cirkulerende immunceller og i leveren.

Forskningsprotokoller til sektion II:

Vi foreslår tre store analyser. Først vil vi udføre genekspressionsprofilering i PBMC-præparater leveret af Dr. Kamal fra patienter med akut HCV. Disse PBMC-præparater udføres som en del af igangværende undersøgelser ledet af Dr. Kamal. For det andet vil vi bruge mikroarray-analyse til at beskrive de hepatiske gener, som ændres af HCV-infektion i post-transplantation levertransplantatet som svar på infektion med HCV. Til dette vil vi bruge dele af leverbiopsier, der allerede er taget som en del af rutinemæssig post-transplantation klinisk behandling. For det tredje vil vi forberede PBMC'er fra patienter med kronisk HCV og ud fra disse bestemme genekspressionsprofiler. Ikke alene er disse en kritisk sammenligning med akut HCV, men de vil også fungere som grundlag for at forudsige resultater af behandling ved kronisk HCV.

IIa. Patientrekruttering, undersøgelsespopulation og indsamling af prøver og data:

I alle tilfælde vil patienter blive identificeret af klinisk personale som potentielle kandidater til undersøgelsen og kontaktet af en undersøgelsessygeplejerske. Der vil blive indhentet samtykke til forskningsanvendelse af vævs- og blodprøver og til indsamling af kliniske patientdata.

Akut HCV: systemisk PBMC-respons Dr. Kamal følger en population af egyptiske sundhedspersonale, der bliver akut inficeret med HCV, og hun isolerer rutinemæssigt PBMC'er fra dem. Denne kliniske population består primært af genotype 1- og genotype 4-inficerede individer og er grundigt beskrevet for patientdemografi, RNA-titer på tidspunktet for blodopsamling og progression til kronisk infektion. I betragtning af den relative sjældenhed af genotype 4 i vores lokale befolkning vil vores indledende analyse fokusere på Genotype 1 akut HCV, men vi agter også at studere genotype 4, da denne genotype har stor relevans for HCV på verdensplan. Baseret på vores tidligere arbejde forventer vi at have behov for mellem 10-20 patienter i en given gruppe for klart at definere konsistente genekspressionsændringer på tværs af et spektrum af klinisk variabilitet. Vi forventer at indsamle og studere PBMC-prøver fra mindst 20 akutte genotype 1-patienter om året. Prøver fra 20 raske kontrolfrivillige vil også blive indhentet i løbet af den 3-årige undersøgelsesperiode (rekrutteret af poster).

Akut HCV: Hepatisk respons på HCV-tilbagefald efter transplantation Vores center udfører 30-40 levertransplantationer hvert år hos personer, der er inficeret med HCV. Alle kliniske data i vores levertransplantationspopulation indtastes i en Oracle-baseret database. Leverbiopsier tages rutinemæssigt fra det HCV-naive transplantat før transplantation og 12, 24 og 52 uger efter transplantationen. Baseret på tidligere erfaringer forventer vi en optjeningsgrad på mindst 80 %; således vil vi være i stand til at indsamle data og prøver fra omkring 24-32 patienter om året. Biopsier af normal lever tages som en del af en igangværende undersøgelse i vores levende donorpopulation (PI: I. McGilvray). 30-40 sådanne biopsier tages hvert år og repræsenterer en unik kilde til kontrollevervæv.

Kronisk HCV: systemisk PBMC-respons Dr. Heathcote følger en stor population af patienter med kronisk HCV. Blodprøver vil blive taget fra patienter, hvor behandling med PegIFN/Rib overvejes, og PBMC'er vil blive isoleret. Baseret på vores erfaring med leverbiopsiundersøgelserne skitseret i fremskridtsrapporten ovenfor, forventer vi at få PBMC-præparater fra mindst 50 patienter hvert år. Omtrent 2/3 af disse er genotype 1-patienter.

IIb. Dataanalyse:

Akut HCV: Genekspressionsændringer som respons på akut HCV i cirkulerende PBMC'er Genekspressionsprofiler fra PBMC'er fra patienter med akut genotype 1 HCV vil blive bestemt og sammenlignet med dem fra normale raske kontroller og kronisk genotype 1 HCV. Gener vil blive identificeret ved statistiske og fold forskelle mellem grupper (p-værdi på <0,01, fold ændring på mindst 1,5). Denne sammenligning vil definere, hvilke genekspressionsændringer, der er specifikke for akut HCV-infektion. For at knytte individuelle gener til udviklingen til kronisk sygdom vil der blive lavet undergruppeanalyser, hvor genekspression hos akut inficerede individer sammenlignes mellem dem, der gik videre til kronisk infektion, og dem, der spontant eliminerede virussen. Efter real-time PCR-bekræftelse af disse gener vil vi bruge en række uovervågede (hierarkisk clustering, hovedkomponenter) og overvågede (nærmeste naboer, lineære diskriminanter) analyser til at udvikle prædiktive gensæt, som præcist klassificerer patienter, der fortsætter med at udvikle kronisk infektion. Tilsammen vil disse resultater identificere de gener, hvis ekspression er ændret i det systemiske immunologiske respons på akut HCV, og hvordan disse relaterer til etableringen af ​​kronisk sygdom. Gener, der er af interesse som mulige terapeutiske mål, vil blive undersøgt yderligere ved anvendelse af HCV-replikonmodellen, som beskrevet tidligere. Ved udgangen af ​​studiets andet år forventer vi at have analyseret 40 akutte genotype 1-patienter, og i det tredje år vil vi analysere 20 genotype 4-patienter.

Akut HCV: lokal hepatisk genekspression i post-transplantation HCV-infektion Genekspressionsprofiler vil blive bestemt ud fra leverbiopsier ved organudtagning, før infektion med HCV og 3, 6 og 12 måneder efter transplantation. Genforandringer kan derfor følges hos samme patient og mellem patienter; geners niveauer vil blive sammenlignet med normalt levervæv og med baseline genekspression i HCV-naive transplantater ved hjælp af statistiske metoder udviklet i vores laboratorium og på EBI. I øjeblikket behandles 70 % af de patienter, der er transplanteret med HCV i vores center, for tilbagevendende HCV efter transplantation efter tegn på tilbagevendende HCV på leverbiopsi, og hos disse patienter udføres kvantitative HCV-titere 3 eller 6 måneder efter transplantationen. Omtrent 80 % af vores patienter gennemfører behandlingen over et 12 måneders forløb. Ved udgangen af ​​vores 3-årige undersøgelse vil vi således kende responsen på behandling af mellem 28-36 patienter (vi forventer en responsrate på 60 %, altså omkring 17-22 respondere og 11-14 non-responders), og til sidst vil vi have data på de 42-54 patienter, der forventes at gennemføre behandlingen. Med denne prøvestørrelse kan vi bestemme, hvilke genundersæt der forudsiger respons på behandling (ved hjælp af metoderne nævnt ovenfor). Ligeledes vil vi være i stand til at relatere genekspression til HCV RNA-titer hos 50-60 patienter. Ved udgangen af ​​det treårige studie vil vi have kliniske og genomiske data på 72 til 90 patienter. I sidste ende vil vi relatere genekspression til udviklingen af ​​tilbagevendende cirrhose, og vi forventer, at omkring 18-30 patienter vil være gået videre til denne tilstand inden for 5 år efter transplantation. For at kontrollere virkningerne af de mange forvirrende faktorer, der kan påvirke hepatisk genekspression efter transplantation (f. akut afstødning, immunsuppression) vil vi udføre undergruppeanalyser ved hjælp af vores omfattende kliniske database. Vi vil sammenligne HCV-behandlingsrespondere med non-respondere, afstødning til ingen afvisning og forskellige immunsuppressive regimer, udover at sammenligne genekspressionsprofiler fra akut hepatisk HCV med dem, der allerede er bestemt for kronisk HCV. Disse analyser vil give os mulighed for at skelne og beskrive virkningerne af akut HCV-infektion på hepatisk genekspression.

Kronisk HCV: cirkulerende PBMC-respons og forudsigelse af behandlingsresultat:

I løbet af de første 2 år af vores undersøgelse vil vi bruge genekspressionsprofilering til at studere PBMC'er fra omkring 30 patienter med kronisk genotype 1 HCV. Disse data vil tjene som en afgørende kontrol for vores undersøgelser af akut HCV i PBMC'er. Alle disse prøver udtages dog fra patienter, der skal videre til behandling med PegIFN/Rib. Derfor vil vi bruge genekspressionsdataene fra disse undersøgelser, ikke kun til sammenligning med de akut inficerede PBMC'er, men også til at bestemme, hvilke genundersæt der er forudsigelige for behandlingsresultater. Disse resultater vil danne grundlag for en ikke-invasiv prognostisk test.

Konklusioner II: Disse undersøgelser vil give en omfattende beskrivelse af de genekspressionsændringer, der ledsager akut HCV-infektion på både systemisk og lokalt niveau. De vil klart identificere gener, som er vigtige for udviklingen til kronisk sygdom og for ugunstige kliniske resultater, og derved foreslå nye prognostiske og terapeutiske mål.