A krónikus vírusos hepatitisben szenvedő egyének májszövetének és vérének eltérő génexpressziója

Ennek a tanulmánynak az a célja, hogy azonosítsa azokat a géneket, amelyek specifikusan felfelé vagy lefelé szabályozottak krónikus vírusos hepatitisben és autoimmun májbetegségben, majd megvizsgálja, hogy ezek az expressziós minták hogyan kapcsolódnak (ha egyáltalán) a klinikai kimenetelhez. A több ezer gén expressziós mintázatának rendkívül hatékony statisztikai eszközöket kell biztosítania a különböző patofiziológiai állapotok megkülönböztetésére. Köztudott, hogy sem a hepatitis B, sem a hepatitis C nem közvetlenül citotoxikus, hatásukat úgy tűnik, hogy az immunválasz közvetíti. Hasonlóan autoimmun májbetegségben szenvedő egyéneknél, pl. Úgy tűnik, hogy a primer biliaris cirrhosis (PBC), a primer szklerotizáló cholangitis (PSC) és az autoimmun hepatitis (AIH) immunmediált mechanizmusai a májbetegségük okai, bár a kiváltó antigén(ek) ismeretlenek. A génexpressziós mintázat támpontokat adhat a betegség okára és patogenezisére egyaránt. Például, ha egy betegséget fertőzés okoz, specifikus citokinválasz figyelhető meg, amely eltérő lesz, ha ez a fertőzés vírusos, bakteriális vagy parazita eredetű. Az is lehetséges, hogy bizonyos válaszmintát váltanak ki, ha a betegséget xenobiotikumra adott válaszként váltják ki. Autoimmun májbetegségben szenvedő betegeknél előfordulhat, hogy egy endogén és/vagy egy exogén antigén indítja el a betegséget, majd ezt követően autoimmun választ okoz. Végül az is lehetséges, hogy egy teljesen váratlan sejtes eseménysor felelős a patogenezisért, és a microarray-kísérletek lehetővé teszik ezen folyamatok felfedezését.

HCV – A hepatitis C vírusfertőzés molekuláris genetikája HCV molekuláris biológia: A HCV egy pozitív szálú RNS Flaviviridae vírus 9,6 kB genommal. A genom körülbelül 3000 aminosavból álló poliproteint kódol, amelyet ezt követően a gazda- és vírusspecifikus proteázok hasítanak, így 4 szerkezeti és 6 nem szerkezeti polipeptid keletkezik. A 4 funkcionális fehérje közé tartozik egy metalloproteináz (NS5A), szerin proteáz (NS3/NS4A), RNS-helikáz (NS3) és egy RNS-függő RNS-polimeráz (NS5B). A HCV hat különböző genotípusát írták le, amelyek közül az 1-es genotípus a legelterjedtebb világszerte, a 4-es genotípus pedig a Közel-Keleten.

A különböző genotípusok eltérően lépnek kölcsönhatásba a gazdaszervezet immunrendszerével, bár ennek molekuláris alapja nem tisztázott. Az 1-es és 4-es genotípus okozta krónikus fertőzés köztudottan rezisztens az IFN-kezelésre, míg a 2-es és 3-as genotípus viszonylag jobb választ ad. Ez a különbség részben az NS5A fehérje mutációinak köszönhető. Sejtmodellekben az NS5A kölcsönhatásba léphet IFN-indukált antivirális enzimekkel, mint például a 2'5'OAS. Más HCV fehérjék valószínűleg kölcsönhatásba lépnek sejtfehérjékkel, hogy megváltoztassák az immun- és IFN antivirális mechanizmusokra adott válaszokat: a HCV magfehérje csillapítja a limfocita Th1 válaszokat, és befolyásolja az IRF, Jak/STAT és iNOS útvonalakat. Bár ezek az eredmények azt sugallják, hogy a vírus hogyan változtathatja meg az ismert sejtpályákat, az immunrendszer víruskerülése többtényezős és egyértelműen összetett.

Kutatási hipotézis: Azok a folyamatok, amelyek az akut HCV-fertőzés fennmaradásához vezetnek, molekuláris szinten összefüggenek azokkal, amelyek a HCV-rezisztenciát okozzák az IFN-terápiával szemben. A gazda/vírus válasz sajátosságainak feltárása mindkét összefüggésben új célpontokat biztosít a kis molekulájú antivirális terápia számára, amely mind akut, mind krónikus HCV-re alkalmazható.

Előrehaladási jelentés: CIHR 106800 Létrehoztunk egy nagy és növekvő szövet- és RNS-regisztert a májbetegségek tanulmányozására, és elvégeztük a krónikus HCV átfogó géntömb elemzését. Néhány legfontosabb megállapításunkat itt részletezzük.

A HCV egy összetett és progresszív betegség, amelyben a gazdaszervezet és a vírus kölcsönhatásának mélyreható hatásai vannak. A klinikai és kísérleti variabilitás kombinációja súlyosan összezavarhatja a génexpressziós vizsgálat eredményeit, és nagyszámú beteg és minta vizsgálatát teszi szükségessé. Az a tény, hogy a májpatológia számos különböző betegségben hasonló lehet, azt is szükségessé teszi, hogy sok különböző beteget és betegséget vegyenek figyelembe az elemzésben. Ennek megfelelően nagyszámú beteget és kontrollt elemeztünk, és gondos adatbázisokat vezettünk a klinikai részletekről annak érdekében, hogy a géntömb adatok többváltozós elemzését elvégezhessük. Jelenleg 19K-s humán microarray-t használtunk a májgénexpresszió meghatározására 86 HCV-betegben, és ezeket hasonlítottuk össze 24 normál, 20 HBV-s és 14 PBC-s beteggel. A tömbadatok kiváló minőségűek: valós idejű PCR-rel történő megerősítési arányunk meghaladja a 80%-ot. Megvizsgáltuk az életkor, a nem, a vírus genotípus (1 vs 2/3), a fibrózis mértéke és a betegségaktivitás relatív hozzájárulását a HCV-fertőzés által leginkább szabályozott génekhez. A konzisztens génexpressziós profilok legfontosabb meghatározója HCV-fertőzötteknél. máj vírus genotípus (1-es genotípus vs. az összes többi). Az 1-es genotípusú mintákon belül azonban egyértelmű különbség van a génexpresszióban.

Ez az eltérő gazda-vírus kölcsönhatás tükröződik a PegIFN/Rib terápiára adott későbbi válaszban. Az összes eddig elemzett HCV májbiopsziát olyan betegektől vettük, akik PegIFN/Rib-kezelésen estek át. Jelenleg 49 betegnél fejeződött be a kezelés. Egy megfigyelés során, amelynek jelentős klinikai hasznossága lehet, kimutattuk, hogy a kezelésre adott végső válasz (tartós vírusválasz versus nem reagáló/relapszus) tükröződik az eredeti génexpressziós profilokban. 18 gént azonosítottunk, amelyek expressziós szintje >90%-os pontossággal különböztette meg a reagálókat a nem reagálóktól/relapszusoktól. Ezen megfigyelés alapján szabadalmat nyújtottunk be a szellemi tulajdon védelmére, és céget alapítottunk a genetikai teszt kereskedelmi forgalomba hozatalára. Az eredményeket publikálásra is benyújtották. Összességében úgy gondoljuk, hogy leírtunk egy génkészletet, vagy talán egy biológiai folyamatot, amely a gazda-HCV kölcsönhatás középpontjában áll.

I. szakasz. Az UBP43, ISG15 útvonal lehetséges szerepe a HCV interferonban Míg génexpressziós profiljaink kétféle krónikus HCV fertőzést különböztetnek meg – az egyik reagál az IFN-re, a másik pedig nem –, fő célunk a specifikus gének és fehérjék szerepe a gazdaszervezet HCV-re adott válaszában. Bár a megváltozott génexpressziós szint nem közvetlenül befolyásolja a génterméket a biológiai úton, nyomós biológiai okok szólnak ahhoz, hogy a listánkon szereplő gének legalább egy része fontos szerepet játszik a vírus-IFN válaszokban. A leginkább szabályozott gének közül több interferonérzékeny (beleértve az OAS, Mx1, ISG15, VIPERIN, IFIT és GIP2 géneket). Az OAS polimorfizmusait gyengén kapcsolták össze az önkorlátozó HCV-fertőzéssel, az Mx1 polimorfizmusait pedig gyengén kapcsolták össze a válaszstátussal. Az OAS, Mx1 és GIP2 máj-mRNS-szintje megemelkedik krónikus HCV-ben, de önmagában egyiket sem kapcsolták össze a kezelés kimenetelével. Azok a gének, amelyek nem reagálnak közvetlenül az IFN-re, szerepet játszhatnak az IFN-válaszok szempontjából fontos sejtpályákban (PI3AP1, DUSP1), és részt vesznek a gyulladásos sejtaktivációban és -érésben (LAP).

Az ISG15 és az UBP43/USP18, amelyek egy újonnan felismert IFN szabályozó útvonal alkotóelemei, a gének talán legérdekesebb részhalmaza, amelyekről azt találtuk, hogy vizsgálataink során eltérően expresszálódnak. Mindkét gén erősebben expresszálódik a nem reagáló (NR) májszövetben, mint a reagáló (R) májszövetben, ami arra utal, hogy interferálhatnak az immunválaszban HCV-fertőzött májban. Az ISG15 egy ubiquitin-szerű (Ubl) fehérje, amelyről úgy gondolják, hogy fontos. a veleszületett immunfunkciókhoz, és kovalensen kapcsolódik a fehérjékhez az interferon aktiválását követően. Ennek a kapcsolatnak a megvalósítása ellentmondásos, és bizonyos átfedéseket rejthet magában az ismert E2 Ub enzimekkel. Érdekes módon az UBCH8 E2 Ub enzimet a közelmúltban az ISG15,34 aktivátoraként azonosították, és ez az egyik olyan gén, amely a krónikus HCV-re adott válaszként felszabályozott microarray elemzésünkben. Az ISG15 konjugációját a célfehérjékhez egy nagyon specifikus proteáz, az USP18/UBP43 fordítja meg. Az UBP43 az Ub-specifikus proteázok családjába tartozik, és IFN, LPS és vírusfertőzés indukálja; az Skp2 Ub ligáz lebontja. Az USP18 elvesztése egerekben IFN-túlérzékenységhez vezet. Adataink összekapcsolják az UBP43-at a HCV-vel, és azt sugallják, hogy az útvonal fontos az eltérő gazda-/vírusválaszban.

Kutatási cél I. HCV replikon modell segítségével megállapítani a 18 gén – különösen az ISG15 és UBP43 – szerepét, amelyek a gazda-vírus divergens interakcióhoz kapcsolódnak.

Az I. szakasz kutatási jegyzőkönyvei:

A DNS microarray vizsgálatok rávilágítanak a sejt transzkripciós állapotára, de nem feltétlenül kapcsolják össze a specifikus géntermékeket a kezelendő biológiai problémával. Ennek megfelelően fontos az egyes gének szerepének tesztelése más megközelítésekkel. A vírusreplikáció in vitro vizsgálatait fogjuk alkalmazni azoknak a géneknek a szerepének tanulmányozására, amelyek expresszióját a HCV-vel fertőzött májban megváltozottnak találtuk. Ezek nem egyszerű kísérletek, mivel a HCV nehezen tanulmányozható vírus. A HCV csak emberekben és csimpánzokban replikálódik, izolált emberi perifériás vérsejtekben pedig csak gyengén, bár ezek extrahepatikus víruskészletként működnek. A szubgenomikus RNS-replikonok bizonyos sejtvonalakba transzfektálhatók és fenntarthatók, de eddig csak néhány genotípust sikerült replikonmodellbe transzformálni (1b, 1a és 2a). Nemrég egy elegáns HCV-modellt írtak le Edmontonban, amelyben humán hepatocitákat ültetnek át SCID-bézs egerekbe. Ez a modell támogatja a HCV fertőzést és replikációt; mivel azonban a HCV-hatások nagy része a vírus által generált immunválasznak köszönhető, ez a jelenleg létező modell nem biztos, hogy ideális annak tanulmányozására, hogy a vírus miként vezet májkárosodáshoz és hogyan kerüli el az antivirális immunválaszt emberekben.

Úgy döntöttünk, hogy feltárjuk érdeklődésre számot tartó génjeink szerepét a teljes hosszúságú HCV genotípus 1a replikon vizsgálatával, Dr. Charles Rice-szal (Rockefeller Egyetem, New York) együttműködve. Ez a replikon a Dr. Rice által a közelmúltban leírt teljes hosszúságú HCV H77 törzs egy változata, de sejttenyészetben magasabb a replikáció szintje, mint az előző változatban. A replikonmodell ideális számos gén hatásának gyors tesztelésére, és széles körben alkalmazták a HCV-mechanizmusok sejtszintű tanulmányozására. Ezt a megközelítést minden olyan gén esetében alkalmazzák, amelyet a fenti vizsgálatokban potenciális érdeklődésre számot tartó génként azonosítottak, először az ISG15 és UBP43 génekre, másodszor a válasz-diszkriminációs listánkban maradt 16 génre, végül pedig a vizsgálatban azonosított új génekre összpontosítva. génexpressziós vizsgálatok alább részletezve.

Ia. Az egyes gének, köztük az UBP43 és az ISG15, siRNS leütésének és upregulációjának (transzfekciójának) hatása a HCV replikonra Huh7.5 sejtekben.

RNS-interferenciát (RNAi) fogunk használni specifikus gének "leütésére" annak érdekében, hogy értékeljük a vírusreplikációban betöltött szerepüket. A homológ egyszálú RNS szekvencia-specifikus lebomlásának indukálására kis kétszálú RNS-molekulákat használnak. A legtöbb ilyen vizsgálatban a törzs Huh7.5 sejteket hasonlítják össze a Dr. Charles Rice laboratóriumában kifejlesztett teljes hosszúságú 1a genotípusú HCV replikont stabilan expresszáló Huh7.5 sejtekkel. Az alábbiakban részletezett módszertan rutinszerű laboratóriumunkban és munkatársaink laboratóriumaiban.

Kontroll vizsgálatok: Kiindulási gén és fehérje expresszió, IFN hatása, replikon hatása:

A replikonrendszer nemcsak egy adott gén vírusreplikációra gyakorolt ​​hatásának tesztelésére használható, hanem az IFN-válaszra gyakorolt ​​hatások vizsgálatára is. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a HCV 1b genotípusú RNS replikációja érzékeny az IFN-a kezelésre, még alacsony dózisok mellett is. Valójában a tizennyolcas listánkon szereplő két gén, az MxA és a GIP3/IFI6-16 szerepét már megvizsgáltuk. A HCV 1b replikon RNS replikációjának IFN gátlása független az MxA-tól, és a GIP3 tranziens transzfekciója önmagában nem gátolja az 1b replikont, de fokozza az IFNa hatását. Most megvizsgáljuk a listánk fennmaradó génjeinek szerepét a HCV 1a genotípusú replikon segítségével. Az alábbiakban ismertetett tanulmányok felvázolják az ISG15 és UBP43 génekkel kapcsolatos megközelítésünket; azonban hasonló stratégiákat alkalmaznak a többi érdeklődésre számot tartó gén esetében is.

A Huh7.5 sejteket és a HCV replikon sejteket 12 órán keresztül növekvő dózisú IFNa2b-vel (0, 1,10 és 100 U/ml), IFNb-vel (0,10,100 és 1000 U/ml) vagy IFNg-vel (0,10,100 és 1000 U/ml), valamint valós idejű PCR-rel meghatározott ISG 15, UBP43 és HCV mRNS szintek. Az ISG15 fehérjeszinteket Western blot segítségével határozzuk meg (mAb Dr. E.C. Borden, Scripps Institute kedves ajándéka); Az UBP43 nyugati vizsgálatára az antitestek létrehozása után kerül sor, vagy amint az antitest elérhetővé válik (jelenleg Dr. D.E. laboratóriumában fejlesztik ki. Zhang, Scripps Intézet). Az RNS izolálását standard Trizol extrakcióval, a fehérje extrakciót pedig a sejtek RIPA pufferben történő lízisével végezzük. Ezek a vizsgálatok meghatározzák az ISG15 és az UBP43 mRNS- és fehérjeszintjét az alapvonalon, valamint az IFN-re, replikonra és replikonra/IFN-re adott válaszként.

Az egyik fontos kérdés annak megerősítése, hogy a gén vagy fehérje expresszálódik ezekben a sejtekben a knock-down kísérletek előtt. Előzetes vizsgálatok során megállapítottuk, hogy mind az ISG15, mind az UBP43 mRNS kiindulási expressziója van mind a Huh7.5, mind a replikon sejtekben (real-time PCR), és hogy az IFNa erősen indukálja az ISG15 fehérje expresszióját a Huh7.5 sejtekben. Ezek az eredmények azt állítják, hogy az ISG15 és UBP43 útvonal releváns ebben a modellben.

siRNS vizsgálatok: Feltételezzük, hogy az UBP43 eliminációja az alapvonalon kisebb HCV RNS replikációhoz vezet, és felerősíti az IFN hatását, az ISG15 eliminációja pedig növeli a kiindulási HCV RNS-t és csökkenti az IFN hatását. A némító és vezérlő siRNS-eket az Ambiontól szerezzük be. Ezeket a GenePorter segítségével transzfektáljuk a gyártó utasításai szerint; A transzfekciós körülményeket az SV40 promoter/enhancer luciferáz kontrollplazmid, pGL2-kontroll használatával optimalizáljuk annak biztosítására, hogy a templátok növekvő mennyisége a luciferáz aktivitás arányos növekedését eredményezze. Negyvennyolc órával a transzfekció után a teljes RNS- vagy fehérjemintákat a korábbiak szerint készítjük elő. Valós idejű PCR-t végzünk az mRNS expressziójának meghatározására siRNS jelenlétében vagy hiányában, és a fehérjeszinteket Western blot segítségével határozzuk meg. A kontrollvizsgálatok elvégzése után az siRNS-gátlás kiindulási és IFN-nel kezelt HCV RNS-replikációra gyakorolt ​​hatását tesztelik.

Transzfekciós vizsgálatok:

Feltételezzük, hogy az UBP43 upregulációja növeli az in vitro HCV RNS replikációt a kiinduláskor, és csökkenti az IFN hatását, az ISG15 upregulációja pedig csökkenti a kiindulási HCV RNS-t és növeli az IFN hatását. Az UBP43 expresszióját a pcDNA6-UBP43 UBP43 expressziós plazmid segítségével szabályozzuk; Az ISG15 expressziós plazmidot úgy kapjuk meg, hogy az ISG15 gént pcDNA6 vektorba szubklónozzuk. Mint korábban, a HCV RNS-szinteket IFNa jelenlétében és távollétében valós idejű PCR segítségével határozzuk meg.

Összességében ezek a vizsgálatok meghatározzák azoknak a géneknek a szerepét, amelyek fontos szerepet játszanak a klinikai PegIFN/Rib-kezelésre reagálók és a nem reagálók közötti különbségtételben.

Ib. Az ISG15/UBP43 útvonal hatásmechanizmusa:

Ha megállapítjuk, hogy az ISG15 és az UBP43 szerepet játszanak a HCV RNS replikációjában az 1-es genotípusú replikon modellben, akkor megvizsgáljuk, hogy ez a hatás hogyan közvetítődik. Meg fogjuk határozni, hogy az UBP43 hatása a proteáz funkciójától vagy egy másik sejtfehérjével való kapcsolatától függ-e. Azt is meghatározzuk, hogy mely ISG15 fehérje célpontok közvetíthetik a hatását.

Az UBP43 proteáz aktivitás szerepe:

Ha kimutatható, hogy az UBP43 eliminációja csökkenti a vírus replikációját vagy felerősíti az interferonválaszt, feltételezzük, hogy az UBP43 gátlása a HCV kezelésének új eszköze lesz. Az UBP43 azért lenne különösen érdekes, mert proteázaktivitása van: a proteázok ismert és validált célpontjai a kis molekulájú terápiáknak. Ezért kritikus lenne annak megállapítása, hogy az UBP43 proteázaktivitása fontos-e a HCV-replikációra gyakorolt ​​hatása szempontjából, és nem például egy másik sejtfehérjével való kölcsönhatása. Ennek a kérdésnek a megválaszolásához túlexpresszáljuk az UBP43 proteáz inaktív konstrukciókat. Az UBP43 inaktív formája egy kritikus cisztein-maradék (Cys61) szerinné történő mutációjával jön létre a pBK/CMV-UBP43 plazmid helyspecifikus mutagenezisével, a korábban leírtak szerint. Az UBP43 proteáz aktív és inaktív formáinak jellemzése érdekében a vad típusú és mutáns UBP43-at GST fúziós fehérjeként fejezzük ki a pGEX-4T-3 (pGEX-4T-3-UBP43) expressziós vektorban, és E. coliba transzformáljuk. BL21 (DE3) egy pET-ISG15-UBP43-H plazmiddal, amely ISG15-UBP43 fúziós fehérjét expresszál.35 Az ISG15 hasítását a fúziós fehérjéről Western blot segítségével mutatjuk ki. Miután megerősítettük, hogy a proteáz funkciót helyspecifikus mutagenezis eliminálja, a vad típusú és mutált UBP43 túlzottan expresszálódik a HCV replikonnal rendelkező Huh7.5 sejtekben, és növekvő dózisú IFNa hatásának lesz kitéve. Ha a proteáz funkció kritikus, az inaktív túlzott expressziója (dominánsan negatív módon) növeli az IFN-re adott választ.

Az ISG15 fehérje célpontjai:

A csecsemőmirigy-szövettel végzett korábbi munkák számos célpontot azonosítottak az ISG15 általi ISGiláció számára, beleértve a Cg1, Jak1 és ERK1 foszfolipázt. Nem ismert, hogy ezek a Huh7.5 sejtekben lévő célpontok-e, bár az ERK-t és a JAK-ot korábban összefüggésbe hozták a HCV-replikon modellben a vírusellenes hatásokkal. Ha azt találjuk, hogy az ISG15 szerepet játszik a HCV replikációjában, akkor megpróbáljuk azonosítani az ISG15 módosításának szubsztrátjait. Először egy sor immunprecipitációs vizsgálatot fogunk végezni, amelyek kifejezetten az ISG15 által korábban módosított fehérjékre irányulnak, és feltárjuk a fertőzött és nem fertőzött sejtek közötti különbségeket. Röviden, a Huh7.5 sejtek +/- replikon IFNa-val történő 12 órás inkubálását követően a sejteket RIPA pufferben lizáljuk, és az ISG15 konjugátumok immunprecipitációját a fent használt anti-ISG15 mAb-vel végezzük. Redukáló gélen történő rezolválás után Western blotot végzünk annak megállapítására, hogy a fenti három célpont konjugált-e az ISG15-tel, a kereskedelemben beszerezhető mAb-k segítségével. Ha a célpontok közül bármelyik vagy mindegyik konjugált, további vizsgálatokat végeznek az ISGiláció következményeinek tisztázására.

A sejttenyészetben ISG15-tel módosított fehérjék teljesebb feltárása érdekében átfogóbb szűrést végzünk tömegspektroszkópiával – az ubiquitin-szerű SUMO fehérje célpontjainak azonosítására korábban alkalmazott stratégiát alkalmazva. A MALDI-TOF tömegspektrometriával párosított TAP-címkézési módszereket fogják alkalmazni. A sejteket TAP- vagy SPA-címkézett ISG15-tel transzfektáljuk, és megtisztítjuk a fehérjét és a fehérjekomplexeket az IFN-nel kezelt vagy kezeletlen sejtekből. A bevált eljárások segítségével ezután gélelektroforézissel és tömegspektrometriával megtisztítjuk és azonosítjuk a szubsztrátokat. A fehérjéket tartalmazó gélszeleteket reduktívan alkilezzük és tripszinolízisnek vetjük alá. A peptideket megtisztítjuk és MALDI-TOF tömegspektrometriával analizáljuk, ciano-4-hidroxicin-namsav mátrixot használva Voyager DE-STR készüléken (Applied Biosystems). A fehérjék azonosítása ezen tömeges ujjlenyomat adatok felhasználásával a ProFound szoftverrel történik. Mivel az MS nem használható a fehérje mennyiségének meghatározására, a számunkra érdekes fehérjéket a különböző körülmények között ISGilált fehérjék listáinak összehasonlításával fogjuk azonosítani, majd Western blot vizsgálatokat végzünk a fehérjemennyiségek összehasonlítására. Ezekben a kísérletekben a Best Institute-ban rendelkezésre álló MS berendezést és szakértelmet fogjuk használni.

Következtetések I: Összességében ezek a vizsgálatok egyértelműen meghatározzák az ISG15 és UBP43 útvonal szerepét az IFN-re adott HCV replikonválaszban, és javaslatot tesznek a hatás közvetítésére. Fontos, hogy a fent leírt módszerek, bár az ISG15 és UBP43 esetében részletezték, általánosak, és alkalmazhatók más, érdeklődésre számot tartó génekre is.

II. szakasz: Az akut hepatitis C vírusfertőzés génexpressziós profilja:

Vannak hasonlóságok az általunk a krónikus betegségben fontosként azonosított útvonalakban azokkal, amelyek fontosak lehetnek az akut fertőzésben. Például a 2'5'OAS polimorfizmusai – a listánkon található gén – megváltoztatják az akut fertőzésből a krónikussá való előrehaladás kockázatát.20 Ezért feltételezzük, hogy ugyanez a génkészlet valószínűleg fontos szerepet játszik az akut fertőzés megszüntetésének kudarcának meghatározásában. Ezt a hipotézist microarray elemzéssel fogjuk tesztelni.

Terveink szerint megvizsgáljuk ezen és más gének szerepét az akut HCV fertőzésben mind a szisztémás, mind a lokális gazda-vírus kölcsönhatásban. Akutan fertőzött májszövetet nehéz megszerezni, mivel a legtöbb akut HCV-fertőzést nem azonosítják, és mert ezekben az esetekben nem megfelelő májbiopsziát végezni. Így két különböző megközelítést fogunk alkalmazni. Először is megvizsgáljuk a génexpressziós mintázatokat a perifériás vér mononukleáris sejtjeiben (PBMC-k), amelyeket akut HCV-vel rendelkező egyiptomi egészségügyi dolgozóktól gyűjtöttek (Dr. Sanaa Kamal), és összehasonlítjuk ezeket a genotípus-egyező krónikus HCV-ben szenvedő betegek PBMC-jeivel és egészségesekkel. önkéntesek. Prediktív modelleket fogunk kidolgozni annak tesztelésére, hogy mely génalcsoportok kapcsolódnak leginkább olyan klinikai kimenetelekhez, mint például a krónikus fertőzés kialakulása. Másodszor, a HCV transzplantáció utáni kiújulását használjuk az akut hepatitis in vivo modelljeként. Biopsziát veszünk a donor májból a transzplantáció ELŐTT, majd nyomon követjük a génexpressziós szinteket az idő múlásával, ahogy a vírus megfertőzi a graftot. A transzplantációt követően a HCV-vel naiv máj gyorsan és általánosan megfertőződik HCV-vel, bár a betegek mindössze 70%-ánál alakul ki szövettani bizonyíték a kiújulásra a transzplantáció után 3 és/vagy 6 hónappal vett májbiopsziákon. Jelenleg ezeket a betegeket kezeljük visszatérő HCV-vel PegIFN/Rib alkalmazásával. A korábbiakhoz hasonlóan prediktív modelleket fogunk kidolgozni a génalcsoportok és a klinikai eredmények összekapcsolására. Több mint 60%-os válaszarányt értünk el a kezelés adherenciájának ösztönzésével a transzplantáció utáni még fárasztóbb mellékhatások ellenére. Így, ami a HCV transzplantáció előtti kezelését illeti, a betegek jelentős része nem reagál a terápiára, és szükségtelenül vannak kitéve kóros mellékhatásoknak: a legfontosabb klinikai kimenetel a PegIFN/Rib-kezelésre adott válasz. További érdekesség a cirrhosis 5 éven belüli gyors kialakulása a betegek 25-30%-ánál, és agresszív fibrózisos cholestaticus állapot kialakulása 7-9%-ban a transzplantációt követő 2 éven belül. Ezek az adatok együttesen mutatják az immunológiai válasz szempontjából fontos géneket, amelyek a betegség fennmaradását vagy eliminációját eredményezik (akut HCV az egészségügyi dolgozókban), valamint a májbetegség progresszióját (átültetés utáni betegek). Az erősen felfelé és lefelé szabályozott géneket a HCV replikonmodellben tovább tanulmányozzuk.

Kutatási cél 2. Meghatározni azokat a génexpressziós profilokat, amelyek leginkább összefüggenek az akut hepatitis klinikai kimenetelével, mind a keringő immunsejtekben, mind a májban.

A II. szakasz kutatási jegyzőkönyvei:

Három fő elemzést javasolunk. Először génexpressziós profilozást végzünk Dr. Kamal által akut HCV-ben szenvedő betegek PBMC-készítményeiben. Ezeket a PBMC-készítményeket Dr. Kamal által vezetett, folyamatban lévő vizsgálatok részeként végzik. Másodszor, microarray analízist fogunk használni azoknak a májgéneknek a leírására, amelyeket a HCV fertőzés megváltoztatott a transzplantáció utáni májtranszplantátumban, válaszul a HCV fertőzésre. Ehhez a rutin transzplantáció utáni klinikai ellátás részeként már vett májbiopsziák részeit használjuk fel. Harmadszor, krónikus HCV-ben szenvedő betegekből PBMC-ket készítünk, és ezekből meghatározzuk a génexpressziós profilokat. Ezek nemcsak kritikus összehasonlítást jelentenek az akut HCV-vel, hanem alapul szolgálnak a krónikus HCV kezelésének kimenetelének előrejelzéséhez is.

IIa. Beteg toborzás, vizsgálati populáció, valamint minták és adatok gyűjtése:

A klinikai személyzet minden esetben potenciális jelöltként azonosítja a betegeket a vizsgálatban, és egy vizsgálati nővér keresi meg őket. A szövet- és vérminták kutatási felhasználásához, valamint a betegek klinikai adatainak gyűjtéséhez hozzájárulást kell kérni.

Akut HCV: szisztémás PBMC válasz Dr. Kamal nyomon követi az egyiptomi egészségügyi dolgozók populációját, akik akut módon megfertőződnek HCV-vel, és rutinszerűen izolálja tőlük a PBMC-ket. Ez a klinikai populáció elsősorban 1-es és 4-es genotípusú fertőzött egyénekből áll, és alaposan leírják a betegek demográfiai adatait, az RNS-titert a vérvétel időpontjában és a krónikus fertőzéssé való progressziót. Tekintettel a 4-es genotípus relatív ritkaságára helyi populációnkban, kezdeti elemzésünk az 1-es genotípusú akut HCV-re összpontosít, de szándékunkban áll a 4-es genotípus vizsgálata is, mivel ennek a genotípusnak világszerte nagy jelentősége van a HCV szempontjából. Korábbi munkánk alapján várhatóan 10-20 betegre lesz szükség egy adott csoportban ahhoz, hogy egyértelműen meghatározzuk a konzisztens génexpressziós változásokat a klinikai variabilitás spektrumában. Évente legalább 20 akut 1-es genotípusú betegtől számítunk PBMC minták gyűjtésére és vizsgálatára. A 3 éves vizsgálati időszak alatt 20 egészséges kontroll önkéntestől is mintát vesznek (a poszter segítségével).

Akut HCV: Májválasz a HCV kiújulására a transzplantáció után Központunkban évente 30-40 májátültetést végeznek HCV-vel fertőzött személyeken. Májtranszplantációs populációnk összes klinikai adata egy Oracle-alapú adatbázisba kerül. A HCV-vel nem kezelt graftból rutinszerűen májbiopsziát vesznek a transzplantáció előtt, valamint a transzplantációt követő 12., 24. és 52. héttel. Az eddigi tapasztalatok alapján legalább 80%-os időbeli elhatárolást várunk; így évente nagyjából 24-32 betegtől tudunk majd adatot és mintát gyűjteni. A normál májból vett biopsziát egy folyamatban lévő, élődonoros populációnkon (PI: I. McGilvray) végzett vizsgálat részeként. Évente 30-40 ilyen biopsziát vesznek, amelyek a kontroll májszövet egyedülálló forrását jelentik.

Krónikus HCV: szisztémás PBMC válasz Dr. Heathcote krónikus HCV-ben szenvedő betegek nagy populációját követi nyomon. Vérmintát vesznek azoktól a betegektől, akiknél a PegIFN/Rib kezelést fontolgatják, és a PBMC-ket izolálják. A fenti előrehaladási jelentésben felvázolt májbiopsziás vizsgálatokkal kapcsolatos tapasztalataink alapján azt várjuk, hogy évente legalább 50 betegtől szerezzünk be PBMC-készítményt. Ezeknek nagyjából 2/3-a 1-es genotípusú beteg.

IIb. Adatelemzés:

Akut HCV: Génexpressziós változások az akut HCV-re adott válaszként keringő PBMC-kben Az akut 1-es genotípusú HCV-ben szenvedő betegek PBMC-iből származó génexpressziós profilokat meghatározzák, és összehasonlítják a normál egészséges kontrollokból és a krónikus 1-es genotípusú HCV-vel. A géneket a csoportok közötti statisztikai és többszörös különbségek alapján azonosítjuk (p-érték <0,01, a szeres változás legalább 1,5). Ez az összehasonlítás meghatározza, hogy mely génexpressziós változások jellemzőek az akut HCV fertőzésre. Annak érdekében, hogy az egyes géneket összefüggésbe lehessen hozni a krónikus betegség előrehaladásával, alcsoport-analíziseket végeznek, amelyek során a génexpressziót akut fertőzött egyénekben összehasonlítják a krónikus fertőzésen átesett és a vírust spontán elimináló egyének génexpressziójával. E gének valós idejű PCR megerősítése után számos felügyelt (hierarchikus klaszterezés, főkomponensek) és felügyelt (legközelebbi szomszédok, lineáris diszkriminánsok) elemzést alkalmazunk prediktív génkészletek kidolgozására, amelyek pontosan osztályozzák a krónikus fertőzésben szenvedő betegeket. Összességében ezek az eredmények azonosítják azokat a géneket, amelyek expressziója megváltozott az akut HCV-re adott szisztémás immunológiai válaszban, és ezek hogyan kapcsolódnak a krónikus betegség kialakulásához. Azokat a géneket, amelyek lehetséges terápiás célpontokként érdekesek, tovább tanulmányozzuk a HCV replikon modell segítségével, amint azt korábban leírtuk. A vizsgálat második évének végére 40 akut 1-es genotípusú beteg elemzését várjuk, a harmadik évben pedig 20 4-es genotípusú beteget.

Akut HCV: lokális májgénexpresszió a transzplantáció utáni HCV fertőzésben A génexpressziós profilokat májbiopsziákból határozzuk meg a szervkivételkor, a HCV-fertőzés előtt, valamint a transzplantáció után 3, 6 és 12 hónappal. A génváltozások tehát követhetők ugyanabban a betegben és betegek között is; A génszinteket a normál májszövettel és a kiindulási génexpresszióval fogjuk összehasonlítani HCV-naív graftokban, laboratóriumunkban és az EBI-ban kifejlesztett statisztikai módszerek segítségével. Jelenleg a központunkban a HCV-vel átültetett betegek 70%-át kezelik visszatérő HCV-vel a transzplantáció után, miután májbiopszián kimutatták a HCV ismétlődését, és ezeknél a betegeknél a transzplantáció után 3 vagy 6 hónappal kvantitatív HCV-titert készítenek. Betegeink nagyjából 80%-a fejezi be a terápiát egy 12 hónapos kúra alatt. Így 3 éves vizsgálatunk végére 28-36 beteg kezelésre adott válaszát fogjuk tudni (60%-os válaszarányt várunk, így nagyjából 17-22 reagáló és 11-14 nem reagáló), és idővel rendelkezünk adatokkal. azon 42-54 betegen, akiktől várhatóan befejezik a terápiát. Ezzel a mintamérettel meg tudjuk határozni, hogy mely génalcsoportok prediktálják a kezelésre adott választ (a fent említett módszerek segítségével). Ugyanígy 50-60 betegnél is képesek leszünk a génexpressziót a HCV RNS titerhez kötni. A három éves vizsgálat végére 72-90 betegről rendelkezünk klinikai és genomikai adatokkal. Végső soron a génexpressziót a visszatérő cirrhosis kialakulásával fogjuk összefüggésbe hozni, és arra számítunk, hogy a transzplantációt követő 5 éven belül nagyjából 18-30 beteg megy át ebbe az állapotba. Annak érdekében, hogy ellenőrizzék a sok zavaró tényező hatását, amelyek befolyásolhatják a máj génexpresszióját a transzplantáció után (pl. akut kilökődés, immunszuppresszió) kiterjedt klinikai adatbázisunk segítségével alcsoport elemzéseket végzünk. Összehasonlítjuk a HCV-kezelésre reagálókat a nem reagálókkal, a kilökődést a nem rejekcióval és a különböző immunszuppresszív kezelési rendeket, valamint összehasonlítjuk az akut hepatikus HCV génexpressziós profilját a krónikus HCV-re már megállapított génexpressziós profilokkal. Ezek az elemzések lehetővé teszik számunkra, hogy megkülönböztetjük és leírjuk az akut HCV-fertőzés hatásait a máj génexpressziójára.

Krónikus HCV: keringő PBMC válasz és a kezelés kimenetelének előrejelzése:

Vizsgálatunk első 2 évében génexpressziós profilozást alkalmazunk körülbelül 30, krónikus 1-es genotípusú HCV-ben szenvedő beteg PBMC-inek tanulmányozására. Ezek az adatok döntő kontrollként szolgálnak majd a PBMC-kben végzett akut HCV-vel kapcsolatos vizsgálatainkhoz. Mindazonáltal ezeket a mintákat olyan betegektől vették, akik PegIFN/Rib-kezelést kapnak. Ezért az ezekből a vizsgálatokból származó génexpressziós adatokat nem csak az akut fertőzött PBMC-kkel való összehasonlításra fogjuk felhasználni, hanem annak meghatározására is, hogy mely génalcsoportok prediktálják a kezelés kimenetelét. Ezek az eredmények képezik a noninvazív prognosztikai teszt alapját.

II. következtetés: Ezek a tanulmányok átfogó leírást adnak az akut HCV fertőzést kísérő génexpressziós változásokról mind szisztémás, mind lokális szinten. Egyértelműen azonosítani fogják azokat a géneket, amelyek fontosak a krónikus betegséggé való előrehaladáshoz és a kedvezőtlen klinikai kimenetelekhez, ezáltal új prognosztikai és terápiás célpontokat javasolnak.