Differenzielle Genexpression von Lebergewebe und Blut von Personen mit chronischer Virushepatitis

Ziel dieser Studie ist es, Gene zu identifizieren, die bei chronischer Virushepatitis und autoimmuner Lebererkrankung spezifisch hoch- oder herunterreguliert werden, und dann zu untersuchen, wie sich diese Expressionsmuster (wenn überhaupt) auf das klinische Ergebnis auswirken. Das Expressionsmuster Tausender Gene sollte äußerst leistungsfähige statistische Werkzeuge zur Unterscheidung verschiedener pathophysiologischer Zustände liefern. Es ist allgemein bekannt, dass weder Hepatitis B noch Hepatitis C direkt zytotoxisch sind; ihre Wirkung scheint über eine Immunantwort vermittelt zu werden. Ähnlich verhält es sich bei Personen mit einer autoimmunen Lebererkrankung, z.B. Bei primär biliärer Zirrhose (PBC), primär sklerosierender Cholangitis (PSC) und Autoimmunhepatitis (AIH) scheinen immunvermittelte Mechanismen die Ursache ihrer Lebererkrankung zu sein, obwohl die auslösenden Antigene unbekannt bleiben. Das Muster der Genexpression kann sowohl Hinweise auf die Ursache als auch auf die Pathogenese einer Krankheit geben. Wenn beispielsweise eine Krankheit durch eine Infektion verursacht wird, wird eine spezifische Zytokinreaktion beobachtet, die anders ausfällt, wenn es sich um eine virale, bakterielle oder parasitäre Infektion handelt. Es ist auch möglich, dass ein bestimmtes Reaktionsmuster hervorgerufen wird, wenn die Krankheit als Reaktion auf Xenobiotika verursacht wird. Bei Patienten mit einer autoimmunen Lebererkrankung ist es möglich, dass ein endogenes und/oder ein exogenes Antigen die Krankheit auslöst und anschließend eine Autoimmunreaktion auslöst. Schließlich ist es auch möglich, dass eine völlig unerwartete Reihe zellulärer Ereignisse für die Pathogenese verantwortlich ist, und die Microarray-Experimente werden es uns ermöglichen, diese Prozesse zu entdecken.

HCV – Die Molekulargenetik der Hepatitis-C-Virusinfektion. HCV-Molekularbiologie: HCV ist ein positivsträngiges RNA-Flaviviridae-Virus mit einem 9,6 kB großen Genom. Das Genom kodiert für ein Polyprotein mit etwa 3000 Aminosäuren, das anschließend durch wirts- und virusspezifische Proteasen gespalten wird, um 4 strukturelle und 6 nichtstrukturelle Polypeptide zu ergeben. Zu den 4 funktionellen Proteinen gehören eine Metalloproteinase (NS5A), eine Serinprotease (NS3/NS4A), eine RNA-Helikase (NS3) und eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (NS5B). Es wurden sechs verschiedene Genotypen von HCV beschrieben, wobei Genotyp 1 weltweit am häufigsten vorkommt und Genotyp 4 im Nahen Osten am häufigsten vorkommt.

Die verschiedenen Genotypen interagieren unterschiedlich mit dem Immunsystem des Wirts, obwohl die molekulare Grundlage dafür unklar ist. Chronische Infektionen durch die Genotypen 1 und 4 sind bekanntermaßen resistent gegen die Behandlung mit IFN, während die Genotypen 2 und 3 vergleichsweise besser ansprechen. Dieser Unterschied kann teilweise auf Mutationen im NS5A-Protein zurückzuführen sein. In Zellmodellen kann NS5A mit IFN-induzierten antiviralen Enzymen wie 2'5'OAS interagieren. Andere HCV-Proteine ​​interagieren wahrscheinlich mit zellulären Proteinen, um Reaktionen auf Immun- und antivirale IFN-Mechanismen zu verändern: Das HCV-Kernprotein dämpft lymphatische Th1-Reaktionen und beeinflusst IRF-, Jak/STAT- und iNOS-Signalwege. Obwohl diese Ergebnisse darauf hindeuten, wie das Virus bekannte Zellwege verändern kann, ist die Umgehung des Immunsystems durch Viren multifaktoriell und eindeutig komplex.

Forschungshypothese: Die Prozesse, die zur Persistenz einer akuten HCV-Infektion führen, hängen auf molekularer Ebene mit denen zusammen, die die HCV-Resistenz gegen die IFN-Therapie fördern. Die Aufklärung der Besonderheiten der Wirts-/Virusreaktion in beiden Kontexten wird neue Angriffspunkte für eine antivirale Therapie mit kleinen Molekülen liefern, die sowohl bei akutem als auch bei chronischem HCV angewendet werden kann.

Fortschrittsbericht: CIHR 106800 Wir haben ein großes und wachsendes Gewebe- und RNA-Register für die Untersuchung von Lebererkrankungen eingerichtet und eine umfassende Gen-Array-Analyse von chronischem HCV durchgeführt. Einige unserer wichtigsten Erkenntnisse finden Sie hier im Detail.

HCV ist eine komplexe und fortschreitende Krankheit, bei der die Interaktion zwischen Wirt und Virus tiefgreifende Auswirkungen hat. Die Kombination aus klinischer und experimenteller Variabilität kann die Ergebnisse einer Genexpressionsstudie ernsthaft verfälschen und erfordert die Untersuchung einer großen Anzahl von Patienten und Proben. Die Tatsache, dass die Leberpathologie bei einer Reihe unterschiedlicher Krankheiten ähnlich sein kann, erfordert auch, dass viele verschiedene Patienten und Krankheiten in die Analyse einbezogen werden. Dementsprechend haben wir eine große Anzahl von Patienten und Kontrollpersonen analysiert und sorgfältige Datenbanken mit klinischen Details gepflegt, um multivariate Analysen der Gen-Array-Daten durchzuführen. Derzeit haben wir einen 19K-Human-Microarray zur Bestimmung der hepatischen Genexpression bei 86 HCV-Patienten verwendet und diese mit 24 normalen, 20 HBV- und 14 PBC-Patienten verglichen. Die Array-Daten sind von hoher Qualität: Unsere Bestätigungsraten durch Echtzeit-PCR liegen bei über 80 %. Wir haben nun die relativen Beiträge von Alter, Geschlecht, viralem Genotyp (1 vs. 2/3), Grad der Fibrose und Krankheitsaktivität auf die Gene untersucht, die durch eine HCV-Infektion am stärksten hochreguliert wurden. Der wichtigste Faktor für konsistente Genexpressionsprofile bei HCV-Infizierten Lebern ist ein viraler Genotyp (Genotyp 1 gegenüber allen anderen). Allerdings gibt es innerhalb der Genotyp-1-Proben einen deutlichen Unterschied in der Genexpression.

Diese unterschiedliche Wirt-Virus-Interaktion spiegelt sich in der anschließenden Reaktion auf die PegIFN/Rib-Therapie wider. Alle bisher von uns analysierten HCV-Leberbiopsien stammten von Patienten, die anschließend eine Behandlung mit PegIFN/Rib erhielten. Derzeit ist die Behandlung bei 49 dieser Patienten abgeschlossen. In einer Beobachtung, die möglicherweise einen erheblichen klinischen Nutzen hat, haben wir gezeigt, dass sich die endgültige Reaktion auf die Behandlung (anhaltende virale Reaktion im Vergleich zu Non-Responder/Relapser) in den ursprünglichen Genexpressionsprofilen widerspiegelte. Wir identifizierten 18 Gene, deren Expressionsniveaus Responder von Non-Respondern/Rezidiven mit einer Genauigkeit von >90 % unterschieden. Basierend auf dieser Beobachtung meldeten wir ein Patent zum Schutz des geistigen Eigentums an und gründeten ein Unternehmen zur Kommerzialisierung des Gentests. Die Ergebnisse wurden ebenfalls zur Veröffentlichung eingereicht. Insgesamt glauben wir, eine Reihe von Genen oder vielleicht einen biologischen Prozess beschrieben zu haben, der der Wirt-HCV-Interaktion zugrunde liegt.

Abschnitt I. Eine mögliche Rolle des UBP43- und ISG15-Signalwegs im HCV-Interferon. Während unsere Genexpressionsprofile zwei Arten chronischer HCV-Infektionen unterschieden haben – eine, die auf IFN reagiert, und die andere, die nicht reagiert – besteht unser Hauptziel darin, ein molekulares Verständnis davon zu erlangen die Rolle spezifischer Gene und Proteine ​​bei der Wirtsreaktion auf HCV. Obwohl ein verändertes Genexpressionsniveau keinen direkten Einfluss auf das Genprodukt im biologischen Signalweg hat, gibt es zwingende biologische Gründe dafür, dass zumindest einige der Gene auf unserer Liste eine wichtige Rolle bei viralen IFN-Reaktionen spielen. Einige der am stärksten hochregulierten Gene sind Interferon-sensitiv (einschließlich OAS, Mx1, ISG15, VIPERIN, IFIT und GIP2). Polymorphismen von OAS wurden schwach mit einer selbstlimitierenden HCV-Infektion in Verbindung gebracht, und Polymorphismen von Mx1 wurden schwach mit dem Reaktionsstatus verknüpft. Die hepatischen mRNA-Spiegel für OAS, Mx1 und GIP2 sind bei chronischer HCV erhöht, aber keine davon allein wurde mit dem Behandlungsergebnis in Verbindung gebracht. Die Gene, die nicht direkt auf IFN reagieren, spielen möglicherweise eine Rolle in zellulären Signalwegen, die für IFN-Reaktionen wichtig sind (PI3AP1, DUSP1) und sind an der Aktivierung und Reifung entzündlicher Zellen (LAP) beteiligt.

ISG15 und UBP43/USP18, die Bestandteile eines neu erkannten IFN-Regulationswegs sind, sind möglicherweise die interessanteste Untergruppe von Genen, die in unseren Studien als unterschiedlich exprimiert wurden. Beide Gene werden im Non-Responder-Lebergewebe (NR) stärker exprimiert als im Responder-Lebergewebe (R), was darauf hindeutet, dass sie die Immunantwort in HCV-infizierter Leber beeinträchtigen könnten. ISG15 ist ein Ubiquitin-ähnliches (Ubl) Protein, das als wichtig angesehen wird an angeborenen Immunfunktionen und wird nach der Interferonaktivierung kovalent an Proteine ​​​​gebunden. Wie diese Verbindung zustande kommt, ist umstritten und kann zu Überschneidungen mit bekannten E2-Ub-Enzymen führen. Interessanterweise wurde das E2-Ub-Enzym UBCH8 kürzlich als Aktivator von ISG15,34 identifiziert und ist eines der Gene, die in unserer Microarray-Analyse als Reaktion auf chronisches HCV hochreguliert wurden. Die Konjugation von ISG15 an seine Zielproteine ​​wird durch eine hochspezifische Protease, USP18/UBP43, umgekehrt. UBP43 gehört zu einer Familie Ub-spezifischer Proteasen und wird durch IFN, LPS und Virusinfektion induziert; es wird durch die Skp2-Ub-Ligase abgebaut. Der Verlust von USP18 führt bei Mäusen zu einer IFN-Überempfindlichkeit. Unsere Daten verbinden UBP43 mit HCV und legen nahe, dass der Signalweg für eine divergente Wirts-/Virusreaktion wichtig ist.

Forschungsziel I. Ermittlung der Rollen der 18 Gene – insbesondere von ISG15 und UBP43 –, die mit einer divergenten Wirt-Virus-Interaktion verbunden sind, unter Verwendung eines HCV-Replikonmodells.

Forschungsprotokolle für Abschnitt I:

DNA-Microarray-Studien geben Aufschluss über den Transkriptionszustand der Zelle, stellen jedoch nicht unbedingt einen Zusammenhang zwischen bestimmten Genprodukten und dem behandelten biologischen Problem her. Dementsprechend ist es wichtig, die Rolle einzelner Gene auch mit anderen Ansätzen zu testen. Wir werden In-vitro-Assays der Virusreplikation verwenden, um die Rolle von Genen zu untersuchen, deren Expression wir in HCV-infizierter Leber verändert haben. Dies sind keine einfachen Experimente, da HCV ein schwer zu untersuchendes Virus ist. HCV repliziert sich nur bei Menschen und Schimpansen und nur schwach in isolierten menschlichen peripheren Blutzellen, obwohl diese als extrahepatischer Viruspool fungieren. Subgenomische RNA-Replikons können in bestimmte Zelllinien transfiziert und aufrechterhalten werden, aber bisher wurden nur wenige Genotypen erfolgreich in ein Replikonmodell übersetzt (1b, 1a und 2a). Kürzlich wurde in Edmonton ein elegantes HCV-Modell beschrieben, bei dem menschliche Hepatozyten in SCID-beige Mäuse transplantiert werden. Dieses Modell unterstützt die HCV-Infektion und -Replikation; Da jedoch der Großteil der HCV-Wirkungen auf die vom Virus erzeugte Immunantwort zurückzuführen ist, ist dieses Modell in seiner derzeitigen Form möglicherweise nicht ideal für die Untersuchung, wie das Virus zu Leberschäden führt und antivirale Immunantworten beim Menschen umgeht.

Wir haben uns entschieden, die Rolle unserer interessierenden Gene mithilfe des HCV-Genotyp-1a-Replikon-Assays in voller Länge in Zusammenarbeit mit Dr. Charles Rice (Rockefeller University, New York) zu untersuchen. Dieses Replikon ist eine Variante des kürzlich von Dr. Rice beschriebenen HCV-H77-Stamms in voller Länge, weist jedoch in Zellkulturen höhere Replikationsraten auf als die vorherige Version. Das Replikonmodell eignet sich ideal zum schnellen Testen der Auswirkungen vieler Gene und wurde häufig zur Untersuchung von HCV-Mechanismen auf zellulärer Ebene eingesetzt. Dieser Ansatz wird für alle Gene verwendet, die in den oben genannten Studien als potenziell interessant identifiziert wurden, wobei der Schwerpunkt zunächst auf den ISG15- und UBP43-Genen liegt, zweitens auf den 16 Genen, die in unserer Antwortdiskriminierungsliste verbleiben, und schließlich auf neuen Genen, die in identifiziert wurden Genexpressionsstudien im Detail unten.

Ia. Auswirkung des siRNA-Knockdowns und der Hochregulierung (Transfektion) einzelner Gene, einschließlich UBP43 und ISG15, auf das HCV-Replikon in Huh7.5-Zellen.

Wir werden RNA-Interferenz (RNAi) nutzen, um bestimmte Gene „auszuschalten“, um ihre Rolle bei der Virusreplikation zu bewerten. Kleine doppelsträngige RNA-Moleküle werden verwendet, um den sequenzspezifischen Abbau homologer einzelsträngiger RNA zu induzieren. Für die meisten dieser Studien werden Stamm-Huh7.5-Zellen mit Huh7.5-Zellen verglichen, die das im Labor von Dr. Charles Rice entwickelte HCV-Replikon des Genotyps 1a in voller Länge stabil exprimieren. Die unten beschriebene Methodik ist in unserem Labor und den Laboren unserer Mitarbeiter Routine.

Kontrollstudien: Baseline-Gen- und Proteinexpression, Wirkung von IFN, Wirkung von Replikon:

Mit dem Replikonsystem kann nicht nur die Wirkung eines bestimmten Gens auf die Virusreplikation getestet werden, sondern auch die Wirkung auf die IFN-Antwort. Frühere Studien haben gezeigt, dass die RNA-Replikation des HCV-1b-Genotyps selbst bei niedrigen Dosen empfindlich auf die IFN-a-Behandlung reagiert. Tatsächlich wurden die Rollen von zwei der Gene auf unserer Liste von achtzehn, MxA und GIP3/IFI6-16, bereits untersucht. Die IFN-Hemmung der RNA-Replikation des HCV-1b-Replikons ist unabhängig von MxA, und eine vorübergehende Transfektion von GIP3 hemmt selbst nicht das 1b-Replikon, verstärkt jedoch die Wirkung von IFNa. Wir werden nun die Rollen der verbleibenden Gene in unserer Liste anhand des HCV-Genotyp-1a-Replikons untersuchen. Die unten beschriebenen Studien skizzieren unseren Ansatz für die Gene ISG15 und UBP43; Für die anderen interessierenden Gene werden jedoch ähnliche Strategien angewendet.

Huh7.5-Zellen und HCV-Replikonzellen werden 12 Stunden lang mit steigenden Dosen von IFNa2b (0, 1,10 und 100 U/ml), IFNb (0,10,100 und 1000 U/ml) oder IFNg (0,10,100 und) inkubiert 1000 U/ml) und ISG 15-, UBP43- und HCV-mRNA-Spiegel, bestimmt durch Echtzeit-PCR. Die ISG15-Proteinspiegel werden durch Western Blot bestimmt (mAb, freundliche Spende von Dr. E.C. Borden, Scripps Institute); UBP43-Weststudien werden durchgeführt, nachdem wir Antikörper entwickelt haben oder sobald der Antikörper verfügbar ist (derzeit wird er im Labor von Dr. D.E. entwickelt). Zhang, Scripps Institute). Die RNA-Isolierung erfolgt durch Standard-Trizol-Extraktion und die Proteinextraktion durch Lyse der Zellen in RIPA-Puffer. In diesen Studien werden die mRNA- und Proteinspiegel für ISG15 und UBP43 zu Studienbeginn und als Reaktion auf IFN, Replikon und Replikon/IFN ermittelt.

Ein wichtiger Punkt ist die Bestätigung, dass das Gen oder Protein von Interesse in diesen Zellen vor den Knock-Down-Experimenten exprimiert wird. In vorläufigen Studien haben wir festgestellt, dass sowohl in Huh7.5- als auch in Replikonzellen eine Basisexpression von ISG15- und UBP43-mRNA vorliegt (Echtzeit-PCR) und dass IFNa die Proteinexpression von ISG15 in Huh7.5-Zellen stark induziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der ISG15- und UBP43-Signalweg für dieses Modell relevant ist.

siRNA-Studien: Wir gehen davon aus, dass die Eliminierung von UBP43 zu einer geringeren HCV-RNA-Replikation zu Studienbeginn führt und die Wirkung von IFN verstärkt, und dass die Eliminierung von ISG15 die HCV-RNA zu Studienbeginn erhöht und die Wirkung von IFN verringert. Stummschaltungs- und Kontroll-siRNAs werden von Ambion bezogen. Diese werden mit GenePorter gemäß den Anweisungen des Herstellers transfiziert; Die Transfektionsbedingungen werden mithilfe des SV40-Promotor-/Enhancer-Luciferase-Kontrollplasmids pGL2-control optimiert, um sicherzustellen, dass steigende Mengen an Templates zu einem proportionalen Anstieg der Luciferase-Aktivität führen. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion werden wie zuvor Gesamt-RNA- oder Proteinproben vorbereitet. Eine Echtzeit-PCR wird durchgeführt, um die mRNA-Expression in Gegenwart oder Abwesenheit von siRNA zu bestimmen, und die Proteingehalte werden durch Western Blot bestimmt. Nachdem diese Kontrollstudien durchgeführt wurden, wird die Wirkung der siRNA-Hemmung auf die Baseline- und IFN-behandelte HCV-RNA-Replikation getestet.

Transfektionsstudien:

Wir gehen davon aus, dass eine Hochregulierung von UBP43 die In-vitro-HCV-RNA-Replikation zu Studienbeginn erhöht und die Wirkung von IFN verringert, und dass eine Hochregulierung von ISG15 die HCV-RNA zu Studienbeginn verringert und die Wirkung von IFN verstärkt. Die UBP43-Expression wird mithilfe eines UBP43-Expressionsplasmids pcDNA6-UBP43 hochreguliert. Das ISG15-Expressionsplasmid wird durch Subklonieren des ISG15-Gens in den pcDNA6-Vektor erhalten. Wie zuvor werden die HCV-RNA-Spiegel in Gegenwart und Abwesenheit von IFNa mittels Echtzeit-PCR bestimmt.

Zusammengenommen werden diese Studien die Rollen der Gene definieren, von denen angenommen wird, dass sie eine wichtige Rolle bei der Unterscheidung zwischen klinischen Ansprechen auf die PegIFN/Rib-Behandlung und Nichtansprechenden spielen.

Ib. Wirkmechanismus des ISG15/UBP43-Signalwegs:

Wenn wir feststellen, dass ISG15 und UBP43 eine Rolle bei der HCV-RNA-Replikation im Genotyp-1-Replikonmodell spielen, werden wir untersuchen, wie dieser Effekt vermittelt wird. Wir werden feststellen, ob die Wirkung von UBP43 von seiner Proteasefunktion oder von seiner Assoziation mit einem anderen zellulären Protein abhängt. Wir werden auch identifizieren, welche ISG15-Proteinziele seine Wirkung vermitteln könnten.

Rolle der UBP43-Proteaseaktivität:

Wenn sich zeigt, dass die Eliminierung von UBP43 die Virusreplikation verringert oder die Interferonreaktion verstärkt, nehmen wir an, dass die Hemmung von UBP43 ein neues Mittel zur Behandlung von HCV darstellen wird. UBP43 wäre von besonderem Interesse, da es Proteaseaktivität aufweist: Proteasen sind bekannte und validierte Ziele für Therapien mit kleinen Molekülen. Daher wäre es von entscheidender Bedeutung festzustellen, ob die Proteaseaktivität von UBP43 für seine Wirkung auf die HCV-Replikation wichtig ist und nicht beispielsweise seine Interaktion mit einem anderen zellulären Protein. Um diese Frage zu beantworten, werden wir UBP43-Protease-inaktive Konstrukte überexprimieren. Eine inaktive Form von UBP43 wird durch Mutation eines kritischen Cysteinrests (Cys61) in Serin mithilfe der ortsgerichteten Mutagenese des pBK/CMV-UBP43-Plasmids wie zuvor beschrieben erzeugt. Um die proteaseaktiven und inaktiven Formen von UBP43 zu charakterisieren, werden Wildtyp und mutiertes UBP43 als GST-Fusionsproteine ​​im Expressionsvektor pGEX-4T-3 (pGEX-4T-3-UBP43) exprimiert und in E.Coli transformiert BL21 (DE3) mit einem Plasmid, pET-ISG15-UBP43-H, das das ISG15-UBP43-Fusionsprotein exprimiert.35 Die Abspaltung von ISG15 vom Fusionsprotein wird durch Western Blot gezeigt. Sobald wir bestätigt haben, dass die Proteasefunktion durch ortsspezifische Mutagenese eliminiert wird, werden Wildtyp- und mutierte UBP43 in Huh7.5-Zellen mit dem HCV-Replikon überexprimiert und steigenden Dosen von IFNa ausgesetzt. Wenn die Proteasefunktion kritisch ist, erhöht eine Überexpression der inaktiven Funktion (in dominant negativer Weise) die Reaktionsfähigkeit auf IFN.

Proteinziele von ISG15:

Frühere Arbeiten mit Thymusgewebe haben mehrere Ziele für die ISGylierung durch ISG15 identifiziert, darunter Phospholipase Cg1, Jak1 und ERK1. Ob es sich dabei um Ziele in Huh7.5-Zellen handelt, ist nicht bekannt, obwohl ERK und JAK zuvor im HCV-Replikonmodell mit antiviralen Wirkungen in Verbindung gebracht wurden. Wenn wir feststellen, dass ISG15 an der HCV-Replikation beteiligt ist, würden wir versuchen, Substrate für die ISG15-Modifikation zu identifizieren. Wir werden zunächst eine Reihe von Immunpräzipitationsstudien durchführen, die speziell auf die Proteine ​​abzielen, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie durch ISG15 verändert werden, und die Unterschiede zwischen infizierten und nicht infizierten Zellen untersuchen. Kurz gesagt: Nach der 12-stündigen Inkubation von Huh7.5-Zellen +/- Replikon mit IFNa werden die Zellen in RIPA-Puffer lysiert und die Immunpräzipitation von ISG15-Konjugaten mit dem oben verwendeten Anti-ISG15-mAb durchgeführt. Nach der Auflösung auf einem reduzierenden Gel werden Western Blots durchgeführt, um mithilfe kommerziell erhältlicher mAbs zu bestimmen, ob die drei oben genannten Ziele durch ISG15 konjugiert sind. Wenn einige oder alle Ziele konjugiert sind, werden weitere Studien durchgeführt, um die Folgen der ISGylierung aufzuklären.

Um umfassender zu untersuchen, welche Proteine ​​in der Zellkultur mit ISG15 modifiziert werden, werden wir ein umfassenderes Screening mittels Massenspektroskopie durchführen und dabei eine Strategie anwenden, die zuvor zur Identifizierung von Zielen des Ubiquitin-ähnlichen SUMO-Proteins verwendet wurde. Es werden TAP-Tagging-Ansätze in Verbindung mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie verwendet. Wir werden Zellen mit TAP- oder SPA-markiertem ISG15 transfizieren und das Protein und die Proteinkomplexe aus mit IFN behandelten oder unbehandelten Zellen reinigen. Anschließend reinigen und identifizieren wir die Substrate mittels etablierter Verfahren mittels Gelelektrophorese und Massenspektrometrie. Gelscheiben, die die Proteine ​​enthalten, werden reduktiv alkyliert und einer Trypsinolyse unterzogen. Die Peptide werden durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie unter Verwendung einer Cyano-4-hydroxycinnamic-Säure-Matrix auf einem Voyager DE-STR-Instrument (Applied Biosystems) gereinigt und analysiert. Die Identifizierung der Proteine ​​anhand dieser Massen-Fingerprinting-Daten wird mit der ProFound-Software durchgeführt. Da MS nicht zur Quantifizierung von Proteinmengen verwendet werden kann, werden wir interessierende Proteine ​​identifizieren, indem wir Listen von Proteinen vergleichen, die unter den verschiedenen Bedingungen ISGyliert wurden, und dann Western-Blot-Studien durchführen, um Proteinmengen zu vergleichen. Bei der Durchführung dieser Experimente werden wir die MS-Ausrüstung und das Fachwissen nutzen, das am Best Institute verfügbar ist.

Schlussfolgerungen I: Zusammengenommen werden diese Studien die Rollen des ISG15- und UBP43-Signalwegs bei der HCV-Replikon-Reaktion auf IFN klar definieren und Hinweise darauf geben, wie die Wirkung vermittelt wird. Wichtig ist, dass die oben beschriebenen Methoden, obwohl sie für ISG15 und UBP43 detailliert beschrieben werden, generisch sind und auf andere interessierende Kandidatengene angewendet werden können.

Abschnitt II: Genexpressionsprofilierung einer akuten Hepatitis-C-Virusinfektion:

Es gibt Ähnlichkeiten zwischen den Signalwegen, die wir bei chronischen Erkrankungen als wichtig identifiziert haben, und denen, die bei akuten Infektionen wichtig sein könnten. Beispielsweise verändern Polymorphismen von 2'5'OAS – einem Gen auf unserer Liste – das Risiko des Übergangs von einer akuten zu einer chronischen Infektion.20 Daher gehen wir davon aus, dass derselbe Satz an Genen wahrscheinlich eine wichtige Rolle dabei spielt, ob eine akute Infektion fehlschlägt. Wir werden diese Hypothese mithilfe einer Microarray-Analyse testen.

Wir planen, die Rolle dieser und anderer Gene bei einer akuten HCV-Infektion sowohl in der systemischen als auch in der lokalen Wirt-Virus-Interaktion zu untersuchen. Akut infiziertes Lebergewebe ist schwer zu gewinnen, da die meisten akuten HCV-Infektionen nicht erkannt werden und es in diesen Fällen ungeeignet ist, Leberbiopsien durchzuführen. Daher werden wir zwei unterschiedliche Ansätze verwenden. Zunächst werden wir die Genexpressionsmuster in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersuchen, die von ägyptischen Mitarbeitern des Gesundheitswesens mit akutem HCV gesammelt wurden (bereitgestellt von Dr. Sanaa Kamal), und diese mit PBMCs von Patienten mit genotypangepasstem chronischem HCV und mit gesunden vergleichen Freiwillige. Wir werden Vorhersagemodelle entwickeln, um zu testen, welche Genuntergruppen am stärksten mit klinischen Ergebnissen wie der Entstehung einer chronischen Infektion verbunden sind. Zweitens werden wir das Wiederauftreten von HCV nach einer Transplantation als Modell für eine akute Hepatitis in vivo verwenden. Wir werden VOR der Transplantation Biopsien der Spenderleber entnehmen und dann die Genexpressionsniveaus im Laufe der Zeit verfolgen, während das Virus das Transplantat infiziert. Nach der Transplantation wird die HCV-naive Leber schnell und überall mit HCV infiziert, obwohl nur 70 % der Patienten bei Leberbiopsien, die 3 und/oder 6 Monate nach der Transplantation entnommen wurden, histologische Hinweise auf ein Wiederauftreten zeigen. Es sind diese Patienten, die wir derzeit mit PegIFN/Rib wegen rezidivierender HCV behandeln. Wie zuvor werden wir Vorhersagemodelle entwickeln, um Genuntergruppen mit klinischen Ergebnissen zu verknüpfen. Wir haben eine Rücklaufquote von mehr als 60 % erreicht, indem wir die Einhaltung der Behandlung trotz der noch zermürbenderen Nebenwirkungen nach der Transplantation gefördert haben. Was die Behandlung von HCV vor der Transplantation betrifft, spricht ein erheblicher Teil der Patienten nicht auf die Therapie an und ist unnötigerweise krankhaften Nebenwirkungen ausgesetzt: Das wichtigste klinische Ergebnis, das wir betrachten werden, ist das Ansprechen auf die Therapie mit PegIFN/Rib. Ein weiteres interessantes Ergebnis ist die rasche Entwicklung einer Zirrhose innerhalb von 5 Jahren bei 25–30 % der Patienten und die Entwicklung eines aggressiven fibrosierenden cholestatischen Zustands bei 7–9 % innerhalb von 2 Jahren nach der Transplantation. Zusammengenommen werden diese Daten auf die Gene hinweisen, die für die immunologische Reaktion wichtig sind, die zur Krankheitspersistenz oder -eliminierung (akutes HCV bei medizinischem Personal) und zum Fortschreiten der Lebererkrankung (Patienten nach Transplantation) führt. Stark hoch- und herunterregulierte Gene werden im HCV-Replikonmodell weiter untersucht.

Forschungsziel 2. Bestimmung der Genexpressionsprofile, die am stärksten mit den klinischen Ergebnissen bei akuter Hepatitis assoziiert sind, sowohl in zirkulierenden Immunzellen als auch in der Leber.

Forschungsprotokolle für Abschnitt II:

Wir schlagen drei Hauptanalysen vor. Zunächst werden wir ein Genexpressionsprofil in von Dr. Kamal bereitgestellten PBMC-Präparaten von Patienten mit akutem HCV durchführen. Diese PBMC-Präparate werden im Rahmen laufender Studien unter der Leitung von Dr. Kamal durchgeführt. Zweitens werden wir eine Microarray-Analyse verwenden, um die Lebergene zu beschreiben, die durch eine HCV-Infektion im Lebertransplantat nach der Transplantation als Reaktion auf eine HCV-Infektion verändert werden. Hierzu werden wir Teile von Leberbiopsien verwenden, die bereits im Rahmen der routinemäßigen klinischen Nachsorge nach Transplantationen entnommen werden. Drittens werden wir PBMCs von Patienten mit chronischer HCV präparieren und daraus Genexpressionsprofile bestimmen. Diese stellen nicht nur einen entscheidenden Vergleich mit akutem HCV dar, sondern dienen auch als Grundlage für die Vorhersage der Behandlungsergebnisse bei chronischem HCV.

IIa. Patientenrekrutierung, Studienpopulation und Sammlung von Proben und Daten:

In allen Fällen werden die Patienten vom klinischen Personal als potenzielle Kandidaten für die Studie identifiziert und von einer Studienkrankenschwester angesprochen. Für die Forschungsverwendung von Gewebe- und Blutproben sowie für die Erhebung klinischer Patientendaten wird eine Einwilligung eingeholt.

Akutes HCV: systemische PBMC-Reaktion Dr. Kamal beobachtet eine Population ägyptischer Gesundheitshelfer, die sich akut mit HCV infizieren, und isoliert routinemäßig PBMCs aus ihnen. Diese klinische Population besteht hauptsächlich aus mit Genotyp 1 und Genotyp 4 infizierten Personen und wird hinsichtlich der Patientendaten, des RNA-Titers zum Zeitpunkt der Blutentnahme und des Fortschreitens zu einer chronischen Infektion ausführlich beschrieben. Angesichts der relativen Seltenheit von Genotyp 4 in unserer lokalen Bevölkerung wird sich unsere erste Analyse auf akutes HCV des Genotyps 1 konzentrieren. Wir beabsichtigen jedoch, auch Genotyp 4 zu untersuchen, da dieser Genotyp für HCV weltweit von großer Bedeutung ist. Basierend auf unserer bisherigen Arbeit gehen wir davon aus, dass in einer bestimmten Gruppe zwischen 10 und 20 Patienten benötigt werden, um konsistente Genexpressionsänderungen über ein Spektrum klinischer Variabilität klar zu definieren. Wir gehen davon aus, dass wir pro Jahr PBMC-Proben von mindestens 20 Patienten mit akutem Genotyp 1 sammeln und untersuchen werden. Während des dreijährigen Studienzeitraums werden auch Proben von 20 gesunden Kontroll-Freiwilligen entnommen (rekrutiert durch Poster).

Akutes HCV: Hepatische Reaktion auf ein HCV-Rezidiv nach einer Transplantation. Unser Zentrum führt jedes Jahr 30–40 Lebertransplantationen bei HCV-infizierten Personen durch. Alle klinischen Daten unserer Lebertransplantationspopulation werden in eine Oracle-basierte Datenbank eingegeben. Vor der Transplantation und 12, 24 und 52 Wochen nach der Transplantation werden routinemäßig Leberbiopsien aus dem HCV-naiven Transplantat entnommen. Basierend auf bisherigen Erfahrungen gehen wir von einer Zuwachsrate von mindestens 80 % aus; Somit werden wir in der Lage sein, Daten und Proben von etwa 24–32 Patienten pro Jahr zu sammeln. Im Rahmen einer laufenden Studie an unserer Lebendspenderpopulation werden Biopsien normaler Leber entnommen (PI: I. McGilvray). Jährlich werden 30–40 solcher Biopsien entnommen und stellen eine einzigartige Quelle für Kontrolllebergewebe dar.

Chronisches HCV: systemische PBMC-Reaktion Dr. Heathcote beobachtet eine große Population von Patienten mit chronischem HCV. Von Patienten, bei denen eine Behandlung mit PegIFN/Rib in Betracht gezogen wird, werden Blutproben entnommen und PBMCs isoliert. Basierend auf unserer Erfahrung mit den im obigen Fortschrittsbericht beschriebenen Leberbiopsiestudien gehen wir davon aus, dass wir jedes Jahr PBMC-Präparate von mindestens 50 Patienten erhalten. Etwa zwei Drittel davon sind Patienten mit Genotyp 1.

IIb. Datenanalyse:

Akutes HCV: Veränderungen der Genexpression als Reaktion auf akutes HCV in zirkulierenden PBMCs Genexpressionsprofile von PBMCs von Patienten mit akutem Genotyp 1 HCV werden bestimmt und mit denen von normalen gesunden Kontrollpersonen und chronischem Genotyp 1 HCV verglichen. Gene werden durch statistische und fache Unterschiede zwischen den Gruppen identifiziert (p-Wert von <0,01, fache Änderung von mindestens 1,5). Dieser Vergleich wird definieren, welche Veränderungen der Genexpression spezifisch für eine akute HCV-Infektion sind. Um einzelne Gene mit dem Fortschreiten zu einer chronischen Erkrankung in Verbindung zu bringen, werden Subgruppenanalysen durchgeführt, in denen die Genexpression bei akut infizierten Personen zwischen denen verglichen wird, die eine chronische Infektion durchgemacht haben, und denen, die das Virus spontan eliminiert haben. Nach der Echtzeit-PCR-Bestätigung dieser Gene werden wir eine Reihe unbeaufsichtigter (hierarchisches Clustering, Hauptkomponenten) und überwachter (nächste Nachbarn, lineare Diskriminanten) Analysen verwenden, um prädiktive Gensätze zu entwickeln, die Patienten, die später eine chronische Infektion entwickeln, genau klassifizieren. Zusammengenommen werden diese Ergebnisse diejenigen Gene identifizieren, deren Expression in der systemischen immunologischen Reaktion auf akutes HCV verändert ist, und wie diese mit der Entstehung chronischer Krankheiten zusammenhängen. Gene, die als mögliche therapeutische Ziele von Interesse sind, werden wie zuvor beschrieben mithilfe des HCV-Replikonmodells weiter untersucht. Bis zum Ende des zweiten Jahres der Studie werden wir voraussichtlich 40 Patienten mit akutem Genotyp 1 analysiert haben, und im dritten Jahr werden wir 20 Patienten mit Genotyp 4 analysieren.

Akutes HCV: lokale hepatische Genexpression bei einer HCV-Infektion nach Transplantation. Genexpressionsprofile werden aus Leberbiopsien bei der Organentnahme, vor der HCV-Infektion und 3, 6 und 12 Monate nach der Transplantation bestimmt. Genveränderungen können daher bei demselben Patienten und zwischen Patienten verfolgt werden; Die Genwerte werden mit normalem Lebergewebe und der Basisgenexpression in HCV-naiven Transplantaten verglichen, wobei statistische Methoden verwendet werden, die in unserem Labor und am EBI entwickelt wurden. Derzeit werden 70 % der in unserem Zentrum mit HCV transplantierten Patienten wegen rezidivierender HCV nach der Transplantation behandelt, nachdem in der Leberbiopsie ein rezidivierendes HCV nachgewiesen wurde. Bei diesen Patienten werden quantitative HCV-Titer 3 oder 6 Monate nach der Transplantation ermittelt. Ungefähr 80 % unserer Patienten schließen die Therapie über einen Zeitraum von 12 Monaten ab. Somit werden wir am Ende unserer dreijährigen Studie das Ansprechen auf die Behandlung von 28 bis 36 Patienten kennen (wir erwarten eine Ansprechrate von 60 %, also etwa 17 bis 22 Responder und 11 bis 14 Nonresponder) und schließlich über Daten verfügen bei den 42–54 Patienten, von denen erwartet wird, dass sie die Therapie abschließen. Mit dieser Stichprobengröße können wir bestimmen, welche Genuntergruppen das Ansprechen auf die Behandlung vorhersagen (unter Verwendung der oben genannten Methoden). Ebenso werden wir in der Lage sein, die Genexpression mit dem HCV-RNA-Titer bei 50–60 Patienten in Beziehung zu setzen. Am Ende der dreijährigen Studie werden wir klinische und genomische Daten von 72 bis 90 Patienten haben. Letztendlich werden wir die Genexpression mit der Entwicklung einer wiederkehrenden Leberzirrhose in Verbindung bringen und gehen davon aus, dass innerhalb von fünf Jahren nach der Transplantation etwa 18 bis 30 Patienten diesen Zustand erreicht haben. Um die Auswirkungen der vielen Störfaktoren zu kontrollieren, die die hepatische Genexpression nach der Transplantation beeinflussen könnten (z. akute Abstoßung, Immunsuppression) werden wir Untergruppenanalysen unter Verwendung unserer umfangreichen klinischen Datenbank durchführen. Wir werden HCV-Behandlungsansprechende mit Nichtansprechenden, Abstoßung mit keiner Abstoßung und verschiedene immunsuppressive Therapien vergleichen und zusätzlich Genexpressionsprofile von akutem hepatischem HCV mit denen vergleichen, die bereits für chronisches HCV ermittelt wurden. Diese Analysen werden es uns ermöglichen, die Auswirkungen einer akuten HCV-Infektion auf die hepatische Genexpression zu unterscheiden und zu beschreiben.

Chronisches HCV: zirkulierende PBMC-Reaktion und Vorhersage des Behandlungsergebnisses:

In den ersten zwei Jahren unserer Studie werden wir Genexpressionsprofile verwenden, um PBMCs von etwa 30 Patienten mit chronischem HCV-Genotyp 1 zu untersuchen. Diese Daten werden als entscheidende Kontrolle für unsere Studien zum akuten HCV bei PBMCs dienen. Alle diese Proben stammen jedoch von Patienten, die anschließend eine Behandlung mit PegIFN/Rib erhalten. Daher werden wir die Genexpressionsdaten aus diesen Studien nicht nur zum Vergleich mit den akut infizierten PBMCs verwenden, sondern auch um zu bestimmen, welche Genuntergruppen das Behandlungsergebnis vorhersagen. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage für einen nichtinvasiven Prognosetest.

Schlussfolgerungen II: Diese Studien werden eine umfassende Beschreibung der Genexpressionsveränderungen liefern, die mit einer akuten HCV-Infektion sowohl auf systemischer als auch auf lokaler Ebene einhergehen. Sie werden Gene eindeutig identifizieren, die für das Fortschreiten einer chronischen Erkrankung und für negative klinische Ergebnisse wichtig sind, und so neue prognostische und therapeutische Ziele vorschlagen.