Expresión génica diferencial de tejido hepático y sangre de individuos con hepatitis viral crónica

El objetivo de este estudio es identificar genes que están específicamente regulados hacia arriba o hacia abajo en la hepatitis viral crónica y la enfermedad hepática autoinmune y luego examinar cómo estos patrones de expresión se relacionan (si es que lo hacen) con el resultado clínico. El patrón de expresión de miles de genes debería proporcionar herramientas estadísticas extremadamente poderosas para distinguir entre diferentes estados fisiopatológicos. Es bien sabido que ni la hepatitis B ni la hepatitis C son directamente citotóxicas, su efecto parece estar mediado por una respuesta inmunitaria. De manera similar, en individuos con enfermedad hepática autoinmune, p. la cirrosis biliar primaria (PBC), la colangitis esclerosante primaria (PSC) y la hepatitis autoinmune (AIH) parecen ser la causa de su enfermedad hepática aunque los antígenos desencadenantes siguen siendo desconocidos. El patrón de expresión génica puede dar pistas sobre la causa y la patogenia de la enfermedad. Por ejemplo, si una enfermedad es causada por una infección, se observa una respuesta específica de citoquinas que será diferente si esta infección es viral, bacteriana o parasitaria. También es posible que se provoque un determinado patrón de respuesta si la enfermedad se produce como respuesta al xenobiótico. En pacientes con enfermedad hepática autoinmune, es posible que un antígeno endógeno y/o exógeno inicie la enfermedad con una respuesta autoinmune posterior. Finalmente, también es posible que una serie completamente inesperada de eventos celulares sea responsable de la patogénesis, y los experimentos con microarreglos nos permitirán descubrir estos procesos.

VHC: la genética molecular de la infección viral de la hepatitis C Biología molecular del VHC: el VHC es un virus Flaviviridae de ARN de cadena positiva con un genoma de 9,6 kB. El genoma codifica una poliproteína de aproximadamente 3000 aminoácidos que posteriormente es escindida por proteasas específicas del virus y del huésped para producir 4 polipéptidos estructurales y 6 no estructurales. Las 4 proteínas funcionales incluyen una metaloproteinasa (NS5A), serina proteasa (NS3/NS4A), ARN helicasa (NS3) y una ARN polimerasa dependiente de ARN (NS5B). Se han descrito seis genotipos diferentes de VHC, siendo el genotipo 1 el más prevalente en todo el mundo y el genotipo 4 el más prevalente en Oriente Medio.

Los diversos genotipos interactúan de manera diferente con el sistema inmunitario del huésped, aunque la base molecular de esto no está clara. La infección crónica por los genotipos 1 y 4 es notoriamente resistente al tratamiento con IFN, mientras que los genotipos 2 y 3 tienen respuestas relativamente mejores. Esta diferencia puede deberse en parte a mutaciones en la proteína NS5A. En modelos celulares, NS5A puede interactuar con enzimas antivirales inducidas por IFN como 2'5'OAS. Es probable que otras proteínas del VHC interactúen con proteínas celulares para alterar las respuestas a los mecanismos antivirales inmunitarios y de IFN: la proteína central del VHC amortigua las respuestas Th1 linfocíticas e influye en las vías IRF, Jak/STAT e iNOS. Aunque estos resultados sugieren cómo el virus puede alterar las vías celulares conocidas, la evasión viral del sistema inmunitario es multifactorial y claramente compleja.

Hipótesis de investigación: Los procesos que conducen a la persistencia de la infección aguda por VHC están relacionados, a nivel molecular, con los que impulsan la resistencia del VHC a la terapia con IFN. Esclarecer los detalles de la respuesta viral/huésped en ambos contextos proporcionará nuevos objetivos para la terapia antiviral de molécula pequeña que se puede aplicar tanto al VHC agudo como crónico.

Informe de progreso: CIHR 106800 Hemos establecido un registro grande y en crecimiento de tejido y ARN para el estudio de la enfermedad hepática, y hemos realizado un análisis integral de la matriz de genes del VHC crónico. Algunos de nuestros hallazgos más importantes se detallan aquí.

El VHC es una enfermedad compleja y progresiva en la que la interacción del huésped y el virus tiene efectos profundos. La combinación de variabilidad clínica y experimental puede confundir seriamente los resultados de un estudio de expresión génica y exige que se examine una gran cantidad de pacientes y muestras. El hecho de que la patología hepática pueda ser similar entre varias enfermedades diferentes también requiere que se incluyan en el análisis muchos pacientes y enfermedades diferentes. En consecuencia, hemos analizado un gran número de pacientes y controles, y hemos mantenido bases de datos cuidadosas de detalles clínicos para realizar análisis multivariados de los datos de la matriz de genes. En la actualidad, hemos utilizado una micromatriz humana de 19K para determinar la expresión génica hepática en 86 pacientes con VHC y los hemos comparado con 24 pacientes normales, 20 con VHB y 14 con CBP. Los datos de matriz son de alta calidad: nuestras tasas de confirmación por PCR en tiempo real superan el 80%. Ahora hemos examinado las contribuciones relativas de la edad, el sexo, el genotipo viral (1 frente a 2/3), el grado de fibrosis y la actividad de la enfermedad en los genes más regulados por la infección por el VHC. El determinante más importante de los perfiles de expresión génica consistentes en los infectados por el VHC hígados es el genotipo viral (genotipo 1 frente a todos los demás). Sin embargo, dentro de las muestras del Genotipo 1 existe una clara diferencia en la expresión génica.

Esta interacción divergente entre el virus y el huésped se refleja en la respuesta posterior a la terapia con PegIFN/Rib. Todas las biopsias de hígado del VHC que hemos analizado hasta la fecha se tomaron de pacientes que continuaron con el tratamiento con PegIFN/Rib. En la actualidad, el tratamiento se ha completado en 49 de estos pacientes. En una observación que puede tener una utilidad clínica significativa, demostramos que la respuesta final al tratamiento (respuesta viral sostenida frente a no respondedor/recidivante) se reflejó en los perfiles de expresión génica originales. Identificamos 18 genes cuyos niveles de expresión distinguieron a los respondedores de los no respondedores/recidivantes con una precisión de >90 %. Con base en esta observación, presentamos una patente para proteger la propiedad intelectual y formamos una empresa para comercializar la prueba genética. Los resultados también han sido enviados para su publicación. En conjunto, creemos que hemos descrito un conjunto de genes, o quizás un proceso biológico, que se encuentra en el corazón de la interacción huésped-VHC.

Sección I. Un posible papel para la vía UBP43, ISG15 en el interferón del VHC Si bien nuestros perfiles de expresión génica han distinguido dos tipos de infección crónica por el VHC, una que responde al IFN y la otra que no, nuestro objetivo principal es lograr una comprensión molecular de las funciones de genes y proteínas específicos en la respuesta del huésped al VHC. Aunque un nivel alterado de expresión génica no implica directamente al producto génico en la ruta biológica, existen razones biológicas convincentes para sugerir que al menos algunos de los genes de nuestra lista juegan un papel importante en las respuestas de IFN viral. Varios de los genes más regulados son sensibles al interferón (incluidos OAS, Mx1, ISG15, VIPERIN, IFIT y GIP2). Los polimorfismos de OAS se han relacionado débilmente con la infección por VHC autolimitada, y los polimorfismos de Mx1 se han relacionado débilmente con el estado de respuesta. Los niveles de ARNm hepático para OAS, Mx1 y GIP2 aumentan en el VHC crónico, pero ninguno, por sí solo, se ha relacionado con el resultado del tratamiento. Los genes que no responden directamente a IFN pueden desempeñar funciones en vías celulares importantes para las respuestas de IFN (PI3AP1, DUSP1) y están implicados en la activación y maduración de células inflamatorias (LAP).

ISG15 y UBP43/USP18, que son componentes de una vía reguladora de IFN recientemente reconocida, son quizás el subconjunto de genes más interesante que se encontró que se expresaba diferencialmente en nuestros estudios. Ambos genes se expresan más en el tejido hepático que no responde (NR) en comparación con el que responde (R), lo que sugiere que podrían interferir con la respuesta inmunitaria en el hígado infectado por el VHC ISG15 es una proteína similar a la ubiquitina (Ubl) que se cree que es importante a las funciones inmunitarias innatas y se une covalentemente a las proteínas después de la activación del interferón. La forma en que se logra este enlace es controvertida y puede implicar cierta superposición con las enzimas E2 Ub conocidas. Curiosamente, la enzima E2 Ub UBCH8 se identificó recientemente como un activador de ISG15,34 y es uno de los genes sobrerregulados en respuesta al VHC crónico en nuestro análisis de micromatrices. La conjugación de ISG15 con sus proteínas diana se invierte mediante una proteasa altamente específica, USP18/UBP43. UBP43 pertenece a una familia de proteasas específicas de Ub y es inducida por IFN, LPS e infección viral; es degradado por la ligasa Skp2 Ub. La pérdida de USP18 en ratones conduce a hipersensibilidad a IFN. Nuestros datos vinculan UBP43 con el VHC y sugieren que la vía es importante en una respuesta viral/huésped divergente.

Objetivo de investigación I. Establecer las funciones de los 18 genes, en particular, de ISG15 y UBP43, asociados con una interacción divergente huésped/virus, utilizando un modelo de replicón de VHC.

Protocolos de Investigación para la Sección I:

Los estudios de micromatrices de ADN arrojan luz sobre el estado de transcripción de la célula, pero no vinculan necesariamente los productos genéticos específicos con el problema biológico que se está abordando. En consecuencia, es importante probar las funciones de los genes individuales utilizando otros enfoques. Usaremos ensayos in vitro de replicación viral para estudiar las funciones de los genes cuya expresión hemos encontrado alterada en el hígado infectado por el VHC. Estos no son experimentos sencillos, ya que el VHC es un virus difícil de estudiar. El VHC se replica solo en humanos y chimpancés, y solo de manera deficiente en células sanguíneas periféricas humanas aisladas, aunque estas actúan como un grupo viral extrahepático. Los replicones de ARN subgenómico pueden transfectarse en ciertas líneas celulares y mantenerse, pero hasta la fecha solo unos pocos genotipos se han traducido con éxito en un modelo de replicón (1b, 1a y 2a). Recientemente, se describió un elegante modelo de VHC en Edmonton en el que se trasplantan hepatocitos humanos en ratones SCID-beige. Este modelo admite la infección y la replicación del VHC; sin embargo, dado que la mayor parte de los efectos del VHC se deben a la respuesta inmunitaria generada por el virus, este modelo tal como existe actualmente puede no ser ideal para estudiar cómo el virus provoca daño hepático y evade las respuestas inmunitarias antivirales en humanos.

Hemos optado por explorar el papel de nuestros genes de interés utilizando el ensayo de replicón de genotipo 1a del VHC de longitud completa, en colaboración con el Dr. Charles Rice (Universidad Rockefeller, Nueva York). Este replicón es una variante de la cepa H77 del VHC de longitud completa descrita recientemente por el Dr. Rice, pero tiene niveles más altos de replicación en cultivo celular que la versión anterior. El modelo de replicón es ideal para probar rápidamente los efectos de muchos genes y se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos del VHC a nivel celular. Este enfoque se utilizará para todos los genes identificados como de interés potencial en los estudios anteriores, enfocándose primero en los genes ISG15 y UBP43, segundo en los 16 genes que quedan en nuestra lista de respuesta discriminatoria y finalmente en nuevos genes identificados en el estudios de expresión génica que se detallan a continuación.

I a. Efecto de la eliminación y regulación positiva (transfección) de siRNA de genes individuales, incluidos UBP43 e ISG15, en el replicón del VHC en células Huh7.5.

Utilizaremos el ARN de interferencia (ARNi) para "derribar" genes específicos con el fin de evaluar sus funciones en la replicación viral. Se utilizarán moléculas pequeñas de ARN de doble cadena para inducir la degradación específica de secuencia del ARN homólogo de cadena sencilla. Para la mayoría de estos estudios, las células madre Huh7.5 se compararán con las células Huh7.5 que expresan de manera estable el replicón del VHC del Genotipo 1a de longitud completa desarrollado en el laboratorio del Dr. Charles Rice. La metodología que se detalla a continuación es de rutina en nuestro laboratorio y en los laboratorios de nuestros colaboradores.

Estudios de control: expresión génica y proteica basal, efecto de IFN, efecto de replicón:

El sistema de replicón se puede usar no solo para probar el efecto de un gen dado en la replicación viral, sino también para los efectos en la respuesta de IFN. Estudios previos han demostrado que la replicación del ARN del genotipo 1b del VHC es sensible al tratamiento con IFN-a, incluso a dosis bajas. De hecho, ya se han examinado las funciones de dos de los genes de nuestra lista de dieciocho, MxA y GIP3/IFI6-16. La inhibición por IFN de la replicación del ARN del replicón 1b del VHC es independiente de MxA, y la transfección transitoria de GIP3 no inhibe por sí misma el replicón 1b pero potencia el efecto de IFNa. Ahora estudiaremos las funciones de los genes restantes en nuestra lista usando el replicón del genotipo 1a del VHC. Los estudios que se describen a continuación describen nuestro enfoque para los genes ISG15 y UBP43; sin embargo, se emplearán estrategias similares para los otros genes de interés.

Las células Huh7.5 y las células con replicón del VHC se incubarán durante 12 horas con dosis crecientes de IFNa2b (0, 1,10 y 100U/ml), IFNb (0,10,100 y 1000 U/ml) o IFNg (0,10,100 y 1000 U/ml), y los niveles de ARNm de ISG 15, UBP43 y HCV determinados por PCR en tiempo real. Los niveles de proteína ISG15 se determinarán mediante western blot (mAb gentileza del Dr. E.C. Borden, Scripps Institute); Los estudios occidentales de UBP43 se realizarán después de que creemos anticuerpos o cuando el anticuerpo esté disponible (actualmente se está desarrollando en el laboratorio del Dr. D.E. Zhang, Instituto Scripps). El aislamiento del ARN se realizará mediante la extracción estándar con Trizol y la extracción de proteínas mediante la lisis de las células en tampón RIPA. Estos estudios establecerán los niveles de proteína y ARNm para ISG15 y UBP43 al inicio y en respuesta a IFN, replicón y replicón/IFN.

Una cuestión importante es confirmar que el gen o la proteína de interés se expresa en estas células antes de los experimentos de eliminación. En estudios preliminares, hemos determinado que existe una expresión inicial de ARNm de ISG15 y UBP43 tanto en células Huh7.5 como replicón (PCR en tiempo real) y que IFNa induce fuertemente la expresión de proteína de ISG15 en células Huh7.5. Estos resultados argumentan que la vía ISG15 y UBP43 es relevante para este modelo.

Estudios de siRNA: Tenemos la hipótesis de que la eliminación de UBP43 conducirá a una menor replicación del ARN del VHC al inicio y aumentará el efecto del IFN, y que la eliminación de ISG15 aumentará el ARN del VHC al inicio y disminuirá el efecto del IFN. Los siRNA de silenciamiento y control se obtendrán de Ambion. Estos se transfectarán usando GenePorter de acuerdo con las instrucciones del fabricante; las condiciones de transfección se optimizarán utilizando el plásmido de control de luciferasa promotor/potenciador SV40, pGL2-control, para garantizar que cantidades cada vez mayores de plantillas resulten en aumentos proporcionales en la actividad de luciferasa. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las muestras de proteína o ARN total se prepararán como antes. Se realizará PCR en tiempo real para determinar la expresión de mRNA en presencia o ausencia de siRNA, y los niveles de proteína se determinarán mediante Western blot. Después de que se hayan realizado estos estudios de control, se evaluará el efecto de la inhibición del ARNsi en la replicación del ARN del VHC en la línea de base y tratada con IFN.

Estudios de transfección:

Presumimos que la regulación al alza de UBP43 aumentará la replicación del ARN del VHC in vitro al inicio y disminuirá el efecto del IFN, y que la regulación al alza de ISG15 disminuirá el ARN del VHC al inicio y aumentará el efecto del IFN. La expresión de UBP43 se regulará positivamente utilizando un plásmido de expresión de UBP43 pcDNA6-UBP43; El plásmido de expresión ISG15 se obtendrá subclonando el gen ISG15 en el vector pcDNA6. Como antes, los niveles de ARN del VHC se determinarán en presencia y ausencia de IFNa mediante PCR en tiempo real.

En conjunto, estos estudios definirán las funciones de los genes sugeridos para desempeñar un papel importante en la distinción entre los respondedores y no respondedores al tratamiento clínico con PegIFN/Rib.

Ib. Mecanismo de acción de la vía ISG15/UBP43:

Si determinamos que ISG15 y UBP43 desempeñan un papel en la replicación del ARN del VHC en el modelo de replicón del genotipo 1, examinaremos cómo se media este efecto. Determinaremos si el efecto de UBP43 depende de su función proteasa o de su asociación con otra proteína celular. También identificaremos qué objetivos de proteína ISG15 podrían mediar su efecto.

Papel de la actividad de la proteasa UBP43:

Si se demuestra que la eliminación de UBP43 reduce la replicación viral o magnifica la respuesta del interferón, planteamos la hipótesis de que la inhibición de UBP43 representará un nuevo medio de tratamiento del VHC. UBP43 sería de particular interés porque tiene actividad de proteasa: las proteasas son objetivos conocidos y validados para terapias de moléculas pequeñas. Por lo tanto, sería fundamental establecer si la actividad proteasa de UBP43 es importante por su efecto sobre la replicación del VHC y no, por ejemplo, su interacción con otra proteína celular. Para abordar esta cuestión, sobreexpresaremos construcciones inactivas de la proteasa UBP43. Se creará una forma inactiva de UBP43 mediante la mutación de un residuo de cisteína crítico (Cys61) en serina usando mutagénesis dirigida al sitio del plásmido pBK/CMV-UBP43 como se describió anteriormente. Con el fin de caracterizar las formas activa e inactiva de la proteasa de UBP43, la UBP43 de tipo salvaje y mutante se expresará como proteínas de fusión GST en el vector de expresión pGEX-4T-3 (pGEX-4T-3-UBP43), y se transformará en E.Coli BL21 (DE3) con un plásmido, pET-ISG15-UBP43-H, que expresa la proteína de fusión ISG15-UBP43.35 La escisión de ISG15 de la proteína de fusión se mostrará mediante transferencia Western. Una vez que hayamos confirmado que la función de la proteasa se elimina mediante mutagénesis dirigida al sitio, la UBP43 de tipo salvaje y mutada se sobreexpresará en células Huh7.5 con el replicón del VHC y se expondrá a dosis crecientes de IFNa. Si la función de la proteasa es crítica, la sobreexpresión de los inactivos (de forma negativa dominante) aumentará la capacidad de respuesta al IFN.

Proteínas dianas de ISG15:

El trabajo anterior con tejido tímico ha identificado varios objetivos para ISGylation por ISG15, incluida la fosfolipasa Cg1, Jak1 y ERK1. No se sabe si estos son objetivos en las células Huh7.5, aunque ERK y JAK se han relacionado previamente con efectos antivirales en el modelo de replicón del VHC. Si encontramos que ISG15 está implicado en la replicación del VHC, buscaríamos identificar sustratos para la modificación de ISG15. En primer lugar, realizaremos una serie de estudios de inmunoprecipitación dirigidos específicamente a las proteínas que ISG15 mostró modificadas anteriormente y exploraremos las diferencias entre las células infectadas y no infectadas. En resumen, después de la incubación de células Huh7.5 +/- replicón con IFNa durante 12 horas, las células se lisarán en tampón RIPA y se realizará inmunoprecipitación de conjugados ISG15 con el mAb anti-ISG15 utilizado anteriormente. Después de la resolución en un gel reductor, se realizarán transferencias Western para determinar si los tres objetivos anteriores están conjugados por ISG15, utilizando mAbs disponibles comercialmente. Si alguno o todos los objetivos se conjugan, se realizarán más estudios para dilucidar las consecuencias de ISGylation.

Para explorar más a fondo qué proteínas se modifican con ISG15 en cultivo celular, realizaremos un examen más completo mediante espectroscopia de masas, aplicando una estrategia utilizada anteriormente para identificar objetivos de la proteína SUMO similar a la ubiquitina. Se utilizarán enfoques de etiquetado TAP junto con espectrometría de masas MALDI-TOF. Transfectaremos células con ISG15 marcado con TAP o marcado con SPA y purificaremos la proteína y los complejos de proteínas de las células tratadas o no tratadas con IFN. Usando procedimientos establecidos, luego purificaremos e identificaremos los sustratos usando electroforesis en gel y espectrometría de masas. Las rebanadas de gel que contienen las proteínas se alquilarán por reducción y se someterán a tripsinólisis. Los péptidos se purificarán y analizarán mediante espectrometría de masas MALDI-TOF utilizando una matriz de ácido ciano-4-hidroxicinámico en un instrumento Voyager DE-STR (Applied Biosystems). La identificación de las proteínas utilizando estos datos de huellas dactilares masivas se llevará a cabo utilizando el software ProFound. Dado que la EM no se puede utilizar para cuantificar las cantidades de proteínas, identificaremos las proteínas de interés comparando listas de proteínas ISGylated en las diversas condiciones y luego realizaremos estudios de transferencia Western para comparar las cantidades de proteínas. Al hacer estos experimentos, utilizaremos el equipo de MS y la experiencia disponible en el Best Institute.

Conclusiones I: En conjunto, estos estudios definirán claramente las funciones de la vía ISG15 y UBP43 en la respuesta del replicón del VHC al IFN, y sugerirán cómo se media el efecto. Es importante destacar que las metodologías descritas anteriormente, aunque detalladas para ISG15 y UBP43, son genéricas y se pueden aplicar a otros genes candidatos de interés.

Sección II: Perfil de expresión génica de la infección viral por hepatitis C aguda:

Hay similitudes en las vías que hemos identificado como importantes en la enfermedad crónica con aquellas que pueden ser importantes en la infección aguda. Por ejemplo, los polimorfismos de 2'5'OAS, un gen que se encuentra en nuestra lista, alteran el riesgo de progresar de infección aguda a crónica.20 Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que es probable que este mismo conjunto de genes desempeñe un papel importante en la determinación del fracaso para eliminar la infección aguda. Probaremos esta hipótesis usando análisis de micromatrices.

Planeamos examinar el papel de estos y otros genes en la infección aguda por VHC tanto en la interacción sistémica como local entre el huésped y el virus. El tejido hepático con infección aguda es difícil de obtener porque la mayoría de las infecciones agudas por VHC no se identifican y porque no es apropiado realizar biopsias hepáticas en estos casos. Por lo tanto, utilizaremos dos enfoques diferentes. En primer lugar, estudiaremos los patrones de expresión génica en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) recolectadas de trabajadores sanitarios egipcios con VHC agudo (proporcionados por la Dra. Sanaa Kamal) y los compararemos con PBMC de pacientes con VHC crónico del mismo genotipo y con PBMC sanos. voluntarios Desarrollaremos modelos predictivos para probar qué subconjuntos de genes están más asociados con resultados clínicos, como el establecimiento de una infección crónica. En segundo lugar, utilizaremos la recurrencia del VHC posterior al trasplante como modelo de hepatitis aguda in vivo. Tomaremos biopsias del hígado del donante ANTES del trasplante y luego seguiremos los niveles de expresión génica a lo largo del tiempo a medida que el virus infecta el injerto. Después del trasplante, el hígado sin VHC se infecta rápida y universalmente con el VHC, aunque solo el 70% de los pacientes desarrollan evidencia histológica de recurrencia en biopsias de hígado tomadas 3 y/o 6 meses después del trasplante. Son estos pacientes los que actualmente tratamos por VHC recurrente usando PegIFN/Rib. Como antes, desarrollaremos modelos predictivos para asociar subconjuntos de genes con resultados clínicos. Hemos logrado una tasa de respuesta de más del 60 % fomentando la adherencia al tratamiento a pesar de los efectos secundarios aún más agotadores después del trasplante. Por lo tanto, en cuanto al tratamiento del VHC antes del trasplante, una fracción significativa de pacientes no responde a la terapia y se exponen innecesariamente a efectos secundarios mórbidos: el resultado clínico clave que consideraremos es la respuesta a la terapia con PegIFN/Rib. Otro resultado de interés es el rápido desarrollo de cirrosis dentro de los 5 años en el 25-30% de los pacientes, y el desarrollo de un estado colestásico fibrosante agresivo en el 7-9% dentro de los 2 años del trasplante. Juntos, estos datos apuntarán a los genes importantes para la respuesta inmunológica que da como resultado la persistencia o eliminación de la enfermedad (VHC agudo en trabajadores de la salud) y la progresión de la enfermedad hepática (pacientes postrasplante). Los genes altamente regulados hacia arriba y hacia abajo se estudiarán más a fondo en el modelo de replicón del VHC.

Objetivo de investigación 2. Determinar los perfiles de expresión génica que están más asociados con los resultados clínicos en la hepatitis aguda, tanto en las células inmunes circulantes como en el hígado.

Protocolos de Investigación para la Sección II:

Proponemos tres análisis principales. Primero, realizaremos perfiles de expresión génica en preparaciones de PBMC proporcionadas por el Dr. Kamal de pacientes con VHC agudo. Estas preparaciones de PBMC se realizan como parte de estudios en curso dirigidos por el Dr. Kamal. En segundo lugar, utilizaremos el análisis de micromatrices para describir los genes hepáticos que están alterados por la infección por VHC en el injerto de hígado postrasplante en respuesta a la infección por VHC. Para ello, utilizaremos porciones de biopsias de hígado que ya se están tomando como parte de la atención clínica de rutina posterior al trasplante. En tercer lugar, prepararemos PBMC de pacientes con VHC crónico y, a partir de ellos, determinaremos los perfiles de expresión génica. No solo son una comparación crítica con el VHC agudo, sino que también actuarán como base para predecir los resultados del tratamiento en el VHC crónico.

IIa. Reclutamiento de pacientes, población de estudio y recogida de muestras y datos:

En todos los casos, el personal clínico identificará a los pacientes como posibles candidatos para el estudio y un enfermero del estudio los abordará. Se obtendrá el consentimiento para el uso de investigación de muestras de tejido y sangre, y para la recopilación de datos clínicos del paciente.

VHC agudo: respuesta sistémica de las PBMC La Dra. Kamal sigue a una población de trabajadores sanitarios egipcios que se infectan de forma aguda con el VHC, y de forma rutinaria aísla las PBMC de ellos. Esta población clínica se compone principalmente de individuos infectados con el genotipo 1 y el genotipo 4, y se describe minuciosamente en cuanto a la demografía de los pacientes, el título de ARN en el momento de la extracción de sangre y la progresión a infección crónica. Dada la rareza relativa del Genotipo 4 en nuestra población local, nuestro análisis inicial se centrará en el VHC agudo del Genotipo 1, pero tenemos la intención de estudiar también el genotipo 4, ya que este genotipo tiene una gran relevancia para el VHC en todo el mundo. Basándonos en nuestro trabajo anterior, anticipamos necesitar entre 10 y 20 pacientes en un grupo determinado para definir claramente los cambios de expresión génica consistentes en un espectro de variabilidad clínica. Esperamos recolectar y estudiar muestras de PBMC de al menos 20 pacientes con genotipo 1 agudo por año. También se obtendrán muestras de 20 voluntarios sanos de control durante el período de estudio de 3 años (reclutados por póster).

VHC agudo: respuesta hepática a la recurrencia del VHC después del trasplante Nuestro centro realiza 30-40 trasplantes de hígado cada año en personas infectadas por el VHC. Todos los datos clínicos en nuestra población de trasplante de hígado se ingresan en una base de datos basada en Oracle. Las biopsias de hígado se toman de forma rutinaria del injerto sin VHC antes del trasplante ya las 12, 24 y 52 semanas después del trasplante. Según la experiencia previa, esperamos una tasa de acumulación de al menos el 80%; por lo tanto, podremos recopilar datos y muestras de aproximadamente 24 a 32 pacientes por año. Se toman biopsias de hígado normal como parte de un estudio en curso en nuestra población de donantes vivos (PI: I. McGilvray). Cada año se toman entre 30 y 40 biopsias de este tipo y representan una fuente única de tejido hepático de control.

VHC crónico: respuesta sistémica de PBMC El Dr. Heathcote sigue a una gran población de pacientes con VHC crónico. Se tomarán muestras de sangre de los pacientes en los que se esté considerando el tratamiento con PegIFN/Rib y se aislarán las PBMC. Según nuestra experiencia con los estudios de biopsia hepática descritos en el Informe de progreso anterior, esperamos obtener preparaciones de PBMC de al menos 50 pacientes cada año. Aproximadamente 2/3 de estos son pacientes del Genotipo 1.

IIb. Análisis de los datos:

VHC agudo: cambios en la expresión génica en respuesta al VHC agudo en PBMC circulantes Se determinarán los perfiles de expresión génica de PBMC de pacientes con VHC de genotipo 1 agudo y se compararán con los de controles sanos normales y VHC de genotipo 1 crónico. Los genes se identificarán mediante diferencias estadísticas y de pliegue entre grupos (valor de p <0,01, cambio de pliegue de al menos 1,5). Esta comparación definirá qué alteraciones de la expresión génica son específicas de la infección aguda por VHC. Para asociar los genes individuales con la progresión a la enfermedad crónica, se realizarán análisis de subgrupos en los que se compare la expresión génica en individuos con infección aguda entre los que pasaron a la infección crónica y los que eliminaron el virus espontáneamente. Después de la confirmación por PCR en tiempo real de estos genes, utilizaremos una serie de análisis no supervisados ​​(agrupación jerárquica, componentes principales) y supervisados ​​(vecinos más cercanos, discriminantes lineales) para desarrollar conjuntos de genes predictivos que clasifiquen con precisión a los pacientes que desarrollan una infección crónica. En conjunto, estos resultados identificarán aquellos genes cuya expresión está alterada en la respuesta inmunológica sistémica al VHC agudo y cómo se relacionan con el establecimiento de la enfermedad crónica. Los genes que son de interés como posibles dianas terapéuticas se estudiarán más a fondo utilizando el modelo de replicón del VHC, como se describió anteriormente. Para el final del segundo año del estudio esperamos haber analizado 40 pacientes con genotipo 1 agudo, y en el tercer año analizaremos 20 pacientes con genotipo 4.

VHC agudo: expresión génica hepática local en la infección por VHC posterior al trasplante Los perfiles de expresión génica se determinarán a partir de biopsias hepáticas en la extracción del órgano, antes de la infección por VHC ya los 3, 6 y 12 meses después del trasplante. Por lo tanto, los cambios genéticos pueden seguirse en el mismo paciente y entre pacientes; los niveles de genes se compararán con el tejido hepático normal y con la expresión génica inicial en injertos sin VHC, utilizando métodos estadísticos desarrollados en nuestro laboratorio y en el EBI. Actualmente el 70% de los pacientes trasplantados de VHC en nuestro centro son tratados por VHC recurrente postrasplante tras evidencia de VHC recurrente en biopsia hepática, y en estos pacientes se realizan títulos cuantitativos de VHC a los 3 o 6 meses postrasplante. Aproximadamente el 80% de nuestros pacientes completan la terapia en un curso de 12 meses. Por lo tanto, al final de nuestro estudio de 3 años, conoceremos la respuesta al tratamiento de entre 28 y 36 pacientes (esperamos una tasa de respuesta del 60 %, por lo tanto, aproximadamente 17 a 22 respondedores y 11 a 14 no respondedores), y finalmente tendremos datos sobre los 42-54 pacientes que se esperaba que completaran la terapia. Con este tamaño de muestra, podemos determinar qué subconjuntos de genes predicen la respuesta al tratamiento (utilizando los métodos mencionados anteriormente). Igualmente, podremos relacionar la expresión génica con el título de ARN del VHC en 50-60 pacientes. Al final del estudio de tres años tendremos datos clínicos y genómicos de 72 a 90 pacientes. En última instancia, relacionaremos la expresión génica con el desarrollo de cirrosis recurrente, y anticipamos que aproximadamente entre 18 y 30 pacientes habrán llegado a este estado dentro de los 5 años posteriores al trasplante. Con el fin de controlar los efectos de los muchos factores de confusión que podrían influir en la expresión de genes hepáticos después del trasplante (p. rechazo agudo, inmunosupresión) realizaremos análisis de subgrupos usando nuestra extensa base de datos clínica. Compararemos los respondedores al tratamiento del VHC con los que no responden, el rechazo con el no rechazo y diferentes regímenes inmunosupresores, además de comparar los perfiles de expresión génica del VHC hepático agudo con los ya determinados para el VHC crónico. Estos análisis nos permitirán distinguir y describir los efectos de la infección aguda por VHC en la expresión génica hepática.

VHC crónico: respuesta de PBMC circulantes y predicción del resultado del tratamiento:

Durante los primeros 2 años de nuestro estudio, utilizaremos perfiles de expresión génica para estudiar las PBMC de aproximadamente 30 pacientes con VHC de genotipo 1 crónico. Estos datos servirán como un control crucial para nuestros estudios de VHC agudo en PBMC. Sin embargo, todas estas muestras se toman de pacientes que seguirán un tratamiento con PegIFN/Rib. Por lo tanto, utilizaremos los datos de expresión génica de estos estudios no solo para compararlos con las PBMC con infección aguda, sino también para determinar qué subconjuntos de genes predicen el resultado del tratamiento. Estos resultados formarán la base para una prueba de pronóstico no invasiva.

Conclusiones II: Estos estudios proporcionarán una descripción completa de los cambios en la expresión génica que acompañan a la infección aguda por VHC tanto a nivel sistémico como local. Identificarán claramente los genes que son importantes para la progresión de la enfermedad crónica y los resultados clínicos adversos, lo que sugiere nuevos objetivos terapéuticos y de pronóstico.