만성 바이러스성 간염 환자의 간 조직 및 혈액의 차등 유전자 발현

이 연구의 목적은 만성 바이러스성 간염 및 자가면역 간 질환에서 특별히 위 또는 아래로 조절되는 유전자를 식별한 다음 이러한 발현 패턴이 임상 결과와 어떻게 관련되는지(만약 있다면) 조사하는 것입니다. 수천 가지 유전자의 발현 패턴은 서로 다른 병태생리학적 상태를 구별할 수 있는 매우 강력한 통계 도구를 제공해야 합니다. B형 간염이나 C형 간염은 직접적인 세포독성이 없으며 그 효과는 면역 반응을 통해 매개되는 것으로 잘 알려져 있습니다. 유사하게 자가면역 간 질환이 있는 개인(예: 원발성 담즙성 간경변증(PBC), 원발성 경화성 담관염(PSC) 및 자가면역성 간염(AIH) 면역 매개 메커니즘은 유발 항원(들)이 알려지지 않았지만 간 질환의 원인인 것으로 보입니다. 유전자 발현 패턴은 질병의 원인과 병인에 대한 단서를 제공할 수 있습니다. 예를 들어 질병이 감염에 의해 발생하는 경우 특정 사이토카인 반응이 관찰되는데, 이 감염이 바이러스성, 세균성 또는 기생충성인 경우에는 다를 것입니다. 질병이 제노바이오틱스에 대한 반응으로 발생하는 경우 특정 반응 패턴이 도출될 수도 있습니다. 자가면역 간질환 환자의 경우, 내인성 및/또는 외인성 항원이 후속 자가면역 반응으로 질병을 개시할 가능성이 있습니다. 마지막으로 완전히 예상치 못한 일련의 세포 사건이 병인의 원인이 될 수도 있으며 마이크로어레이 실험을 통해 이러한 과정을 발견할 수 있습니다.

HCV - C형 간염 바이러스 감염의 분자 유전학 HCV 분자 생물학: HCV는 9.6kB 게놈을 가진 양가닥 RNA Flaviviridae 바이러스입니다. 게놈은 약 3000개 아미노산의 다단백질을 암호화하며, 이후 숙주 및 바이러스 특이적 프로테아제에 의해 절단되어 4개의 구조적 및 6개의 비구조적 폴리펩티드를 생성합니다. 4가지 기능성 단백질에는 메탈로프로테이나제(NS5A), 세린 프로테아제(NS3/NS4A), RNA 헬리카제(NS3) 및 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(NS5B)가 포함됩니다. HCV의 6가지 다른 유전자형이 기술되었으며, 유전자형 1은 전 세계적으로 가장 널리 퍼져 있고 유전자형 4는 중동에서 가장 널리 퍼져 있습니다.

다양한 유전자형은 숙주 면역 체계와 다르게 상호 작용하지만 이에 대한 분자 기반은 불분명합니다. 유전자형 1형과 4형에 의한 만성 감염은 IFN 치료에 악명 높게 저항하는 반면, 유전자형 2형과 3형은 상대적으로 더 나은 반응을 나타냅니다. 이 차이는 부분적으로 NS5A 단백질의 돌연변이로 인한 것일 수 있습니다. 세포 모델에서 NS5A는 2'5'OAS와 같은 IFN 유도 항바이러스 효소와 상호작용할 수 있습니다. 다른 HCV 단백질은 면역 및 IFN 항바이러스 메커니즘에 대한 반응을 변경하기 위해 세포 단백질과 상호 작용할 가능성이 있습니다. HCV 코어 단백질은 림프구 Th1 반응을 약화시키고 IRF, Jak/STAT 및 iNOS 경로에 영향을 미칩니다. 이러한 결과는 바이러스가 어떻게 알려진 세포 경로를 변경할 수 있는지를 시사하지만, 면역 체계의 바이러스 회피는 다인자적이며 명확하게 복잡합니다.

연구 가설: 급성 HCV 감염을 지속시키는 과정은 분자 수준에서 IFN 요법에 대한 HCV 내성을 유발하는 과정과 관련이 있습니다. 이러한 맥락 모두에서 숙주/바이러스 반응의 특성을 밝히는 것은 급성 및 만성 HCV 모두에 적용될 수 있는 소분자 항바이러스 요법에 대한 새로운 표적을 제공할 것입니다.

진행 보고서: CIHR 106800 우리는 간 질환 연구를 위한 대규모 성장 조직 및 RNA 레지스트리를 구축했으며 만성 HCV에 대한 포괄적인 유전자 배열 분석을 수행했습니다. 우리의 가장 중요한 발견 중 일부는 여기에 자세히 설명되어 있습니다.

HCV는 숙주와 바이러스의 상호 작용이 중대한 영향을 미치는 복잡하고 진행성인 질병입니다. 임상적 및 실험적 가변성의 조합은 유전자 발현 연구의 결과를 심각하게 혼동시킬 수 있으며 많은 수의 환자와 샘플을 검사해야 합니다. 간 병리가 많은 다른 질병들 사이에서 유사할 수 있다는 사실은 또한 많은 다른 환자들과 질병들이 분석에 포함되는 것을 필요로 합니다. 따라서 우리는 유전자 배열 데이터의 다변량 분석을 수행하기 위해 많은 수의 환자와 대조군을 분석하고 임상 세부 사항에 대한 신중한 데이터베이스를 유지했습니다. 현재 우리는 86명의 HCV 환자에서 간 유전자 발현을 결정하기 위해 19K 인간 마이크로어레이를 사용했고 이들을 24명의 정상 환자, 20명의 HBV 및 14명의 PBC 환자와 비교했습니다. 어레이 데이터는 고품질입니다. 실시간 PCR에 의한 확인률은 80%를 초과합니다. 우리는 이제 연령, 성별, 바이러스 유전자형(1 대 2/3), 섬유화 정도 및 HCV 감염에 의해 가장 많이 상향 조절되는 유전자에 대한 질병 활동의 상대적 기여도를 조사했습니다. HCV 감염에서 일관된 유전자 발현 프로파일의 가장 중요한 결정 요인 간은 바이러스 유전자형입니다(유전자형 1 대 다른 모든 유전자형). 그러나 유전자형 1 샘플 내에서는 유전자 발현에 분명한 차이가 있습니다.

이 다양한 숙주-바이러스 상호작용은 PegIFN/Rib 요법에 대한 후속 반응에 반영됩니다. 지금까지 우리가 분석한 모든 HCV 간 생검은 PegIFN/Rib로 치료를 계속한 환자에게서 채취했습니다. 현재 이들 환자 중 49명이 치료를 마쳤다. 상당한 임상적 유용성을 가질 수 있는 관찰에서, 우리는 치료에 대한 궁극적인 반응(지속적인 바이러스 반응 대 비반응자/재발자)이 원래의 유전자 발현 프로필에 반영되었음을 보여주었습니다. 우리는 발현 수준이 >90%의 정확도로 반응자를 비반응자/재발자로부터 구별하는 18개의 유전자를 확인했습니다. 이러한 관찰을 바탕으로 지적재산권을 보호하기 위해 특허를 출원하고 유전자 검사를 상용화하기 위해 회사를 설립했습니다. 결과는 출판을 위해 제출되었습니다. 종합하면 우리는 숙주-HCV 상호작용의 중심에 있는 일련의 유전자 또는 아마도 생물학적 과정을 기술했다고 믿습니다.

섹션 I. HCV 인터페론에서 UBP43, ISG15 경로의 가능한 역할 우리의 유전자 발현 프로파일은 두 가지 유형의 만성 HCV 감염을 구별했습니다. 하나는 IFN에 반응하고 다른 하나는 그렇지 않습니다. HCV에 대한 숙주 반응에서 특정 유전자 및 단백질의 역할. 변경된 유전자 발현 수준이 생물학적 경로의 유전자 산물과 직접적으로 연관되지는 않지만, 우리 목록에 있는 유전자 중 적어도 일부가 바이러스-IFN 반응에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 설득력 있는 생물학적 이유가 있습니다. 가장 많이 상향 조절된 유전자 중 일부는 인터페론에 민감합니다(OAS, Mx1, ISG15, VIPERIN, IFIT 및 GIP2 포함). OAS의 다형성은 자가 제한적 HCV 감염과 약하게 연결되어 있으며 Mx1의 다형성은 반응 상태와 약하게 연결되어 있습니다. OAS, Mx1 및 GIP2에 대한 간장 mRNA 수준은 만성 HCV에서 증가하지만, 단독으로는 치료 결과와 관련이 없습니다. IFN에 직접 반응하지 않는 유전자는 IFN 반응(PI3AP1, DUSP1)에 중요한 세포 경로에서 역할을 할 수 있으며 염증 세포 활성화 및 성숙(LAP)에 관여합니다.

새로 인식된 IFN 조절 경로의 구성 요소인 ISG15 및 UBP43/USP18은 아마도 우리 연구에서 차등적으로 발현되는 것으로 밝혀진 가장 흥미로운 유전자 하위 집합일 것입니다. 두 유전자 모두 응답자(R) 간 조직과 비교하여 무응답자(NR)에서 더 많이 발현되어 HCV 감염 간에서 면역 반응을 방해할 수 있음을 시사합니다. ISG15는 중요한 것으로 생각되는 유비퀴틴 유사(Ubl) 단백질입니다. 선천적 면역 기능에 영향을 미치며 인터페론 활성화 후 단백질에 공유 결합됩니다. 이 연결이 달성되는 방법은 논란의 여지가 있으며 알려진 E2 Ub 효소와 일부 중복될 수 있습니다. 흥미롭게도, E2 Ub 효소 UBCH8은 최근 ISG15,34의 활성제로 확인되었으며 마이크로어레이 분석에서 만성 HCV에 대한 반응으로 상향 조절되는 유전자 중 하나입니다. 표적 단백질에 대한 ISG15의 컨쥬게이션은 고도로 특이적인 프로테아제인 USP18/UBP43에 의해 역전됩니다. UBP43은 Ub-특이적 프로테아제 계열에 속하며 IFN, LPS 및 바이러스 감염에 의해 유도됩니다. Skp2 Ub ligase에 의해 분해됩니다. 마우스에서 USP18의 손실은 IFN 과민증을 초래합니다. 우리의 데이터는 UBP43과 HCV를 연결하고 경로가 다양한 호스트/바이러스 반응에서 중요함을 시사합니다.

연구 목표 I. HCV 레플리콘 모델을 사용하여 다양한 숙주/바이러스 상호작용과 관련된 18개 유전자, 특히 ISG15 및 UBP43의 역할을 확립합니다.

섹션 I에 대한 연구 프로토콜:

DNA 마이크로어레이 연구는 세포의 전사 상태를 밝혀주지만 특정 유전자 산물을 해결하려는 생물학적 문제와 반드시 연결하지는 않습니다. 따라서 다른 접근법을 사용하여 개별 유전자의 역할을 테스트하는 것이 중요합니다. 우리는 HCV 감염 간에서 발현이 변경된 것으로 밝혀진 유전자의 역할을 연구하기 위해 바이러스 복제의 시험관 내 분석을 사용할 것입니다. HCV는 연구하기 어려운 바이러스이기 때문에 간단한 실험이 아닙니다. HCV는 인간과 침팬지에서만 복제되며 분리된 인간 말초 혈액 세포에서만 제대로 복제되지 않지만 이들은 간외 바이러스 풀로 작용합니다. 서브게놈 RNA 레플리콘은 특정 세포주에 형질감염되어 유지될 수 있지만 현재까지 소수의 유전자형만이 레플리콘 모델로 성공적으로 변환되었습니다(1b, 1a 및 2a). 최근에 인간 간세포를 SCID 베이지색 마우스에 이식한 우아한 HCV 모델이 Edmonton에서 기술되었습니다. 이 모델은 HCV 감염 및 복제를 지원합니다. 그러나 HCV 효과의 대부분은 바이러스에 의해 생성된 면역 반응에 기인하기 때문에 현재 존재하는 이 모델은 바이러스가 인간의 간 손상을 유발하고 항바이러스 면역 반응을 회피하는 방법을 연구하는 데 이상적이지 않을 수 있습니다.

우리는 Charles Rice 박사(Rockefeller University, New York)와 공동으로 전장 HCV 유전자형 1a 레플리콘 분석을 사용하여 관심 있는 유전자의 역할을 탐구하기로 선택했습니다. 이 레플리콘은 Dr. Rice가 최근에 기술한 전체 길이 HCV H77 균주의 변종이지만 이전 버전보다 세포 배양에서 복제 수준이 더 높습니다. 레플리콘 모델은 많은 유전자의 효과를 빠르게 테스트하는 데 이상적이며 세포 수준에서 HCV 메커니즘을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 이 접근법은 위의 연구에서 잠재적인 관심 대상으로 식별된 모든 유전자에 사용될 것이며, 먼저 ISG15 및 UBP43 유전자에 초점을 맞추고, 두 번째로 우리의 반응 차별 목록에 남아 있는 16개의 유전자에 초점을 맞추고, 마지막으로 유전자 발현 연구는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

Ia. UBP43 및 ISG15를 포함한 개별 유전자의 siRNA 녹다운 및 상향조절(형질감염)이 Huh7.5 세포의 HCV 레플리콘에 미치는 영향.

바이러스 복제에 대한 역할을 평가하기 위해 RNA 간섭(RNAi)을 사용하여 특정 유전자를 "녹다운"합니다. 작은 이중 가닥 RNA 분자는 상동 단일 가닥 RNA의 서열 특이적 분해를 유도하는 데 사용될 것입니다. 대부분의 이러한 연구에서 스톡 Huh7.5 세포는 찰스 라이스 박사의 실험실에서 개발된 전장 유전자형 1a HCV 레플리콘을 안정적으로 발현하는 Huh7.5 세포와 비교될 것입니다. 아래에 설명된 방법론은 우리 실험실과 공동 작업자의 실험실에서 일상적인 것입니다.

대조군 연구: 기준선 유전자 및 단백질 발현, IFN 효과, 레플리콘 효과:

레플리콘 시스템은 주어진 유전자가 바이러스 복제에 미치는 영향을 테스트하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 IFN 반응에 미치는 영향에도 사용할 수 있습니다. 이전 연구는 HCV 1b 유전자형 RNA 복제가 저용량에서도 IFN-a 치료에 민감하다는 것을 입증했습니다. 사실, 우리의 18개 목록에 있는 두 유전자, MxA 및 GIP3/IFI6-16의 역할은 이미 조사되었습니다. HCV 1b 레플리콘 RNA 복제의 IFN 억제는 MxA와 무관하며 GIP3의 일시적인 형질감염은 그 자체로 1b 레플리콘을 억제하지 않지만 IFNa의 효과를 강화합니다. 이제 HCV 유전자형 1a 레플리콘을 사용하여 목록에 있는 나머지 유전자의 역할을 연구할 것입니다. 아래에 설명된 연구는 ISG15 및 UBP43 유전자에 대한 접근 방식을 설명합니다. 그러나 관심있는 다른 유전자에 대해서도 유사한 전략이 사용될 것입니다.

Huh7.5 세포 및 HCV 레플리콘 세포는 IFNa2b(0, 1,10 및 100U/ml), IFNb(0,10,100 및 1000U/ml) 또는 IFNg(0,10,100 및 100U/ml)의 용량을 증가시키면서 12시간 동안 배양될 것이다. 1000 U/ml), ISG 15, UBP43 및 실시간 PCR로 측정한 HCV mRNA 수준. ISG15 단백질 수준은 웨스턴 블롯(Scripps Institute의 Dr. E.C. Borden의 친절한 선물인 mAb)에 의해 결정될 것입니다. UBP43 western 연구는 우리가 항체를 생성한 후 또는 항체가 사용 가능해지면 수행될 것입니다(현재 Dr. D.E.의 연구실에서 개발 중입니다). 장, 스크립스 연구소). RNA 분리는 표준 Trizol 추출 및 RIPA 버퍼에서 세포를 용해하여 단백질 추출에 의해 수행됩니다. 이러한 연구는 기준선에서 그리고 IFN, 레플리콘 및 레플리콘/IFN에 대한 반응으로 ISG15 및 UBP43에 대한 mRNA 및 단백질 수준을 확립할 것입니다.

한 가지 중요한 문제는 녹다운 실험 전에 유전자 또는 관심 단백질이 이러한 세포에서 발현되는지 확인하는 것입니다. 예비 연구에서 우리는 Huh7.5 및 레플리콘 세포(실시간 PCR) 모두에서 ISG15 및 UBP43 mRNA 모두의 기준선 발현이 있고 IFNa가 Huh7.5 세포에서 ISG15의 단백질 발현을 강력하게 유도한다는 것을 결정했습니다. 이러한 결과는 ISG15 및 UBP43 경로가 이 모델과 관련이 있음을 주장합니다.

siRNA 연구: 우리는 UBP43을 제거하면 기준선에서 HCV RNA 복제가 줄어들고 IFN의 효과가 확대될 것이며 ISG15가 제거되면 기준선에서 HCV RNA가 증가하고 IFN의 효과가 감소할 것이라는 가설을 세웁니다. 사일런싱 및 제어 siRNA는 Ambion에서 얻을 수 있습니다. 이들은 제조업체의 지침에 따라 GenePorter를 사용하여 형질감염됩니다. 형질주입 조건은 SV40 프로모터/인핸서 루시퍼라제 제어 플라스미드, pGL2-제어를 사용하여 최적화되어 주형의 양이 증가하면 루시퍼라제 활성이 그에 비례하여 증가합니다. 형질감염 48시간 후, 전과 같이 전체 RNA 또는 단백질 샘플을 준비합니다. 실시간 PCR은 siRNA의 존재 또는 부재 하에 mRNA 발현을 결정하기 위해 수행될 것이고, 단백질 수준은 웨스턴 블롯에 의해 결정될 것이다. 이러한 대조 연구를 수행한 후, 기준선 및 IFN 처리된 HCV RNA 복제에 대한 siRNA 억제 효과를 테스트할 것입니다.

형질감염 연구:

우리는 UBP43의 상향 조절이 기준선에서 시험관 내 HCV RNA 복제를 증가시키고 IFN의 효과를 감소시킬 것이며, ISG15의 상향 조절이 기준선 HCV RNA를 감소시키고 IFN의 효과를 증가시킬 것이라는 가설을 세웁니다. UBP43 발현은 UBP43 발현 플라스미드 pcDNA6-UBP43을 사용하여 상향조절될 것이다; ISG15 발현 플라스미드는 ISG15 유전자를 pcDNA6 벡터에 서브클로닝하여 얻을 수 있습니다. 전과 같이, HCV RNA 수준은 실시간 PCR을 사용하여 IFNa의 존재 및 부재에서 결정될 것이다.

이들 연구를 종합하면 임상 PegIFN/Rib 치료 반응자와 비반응자를 구별하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 제안된 유전자의 역할을 정의할 것입니다.

Ib. ISG15/UBP43 경로의 작용 메커니즘:

ISG15와 UBP43이 유전자형 1 레플리콘 모델에서 HCV RNA 복제에 역할을 한다고 판단되면 이 효과가 어떻게 매개되는지 조사할 것입니다. 우리는 UBP43의 효과가 프로테아제 기능에 의존하는지 또는 다른 세포 단백질과의 연관성에 의존하는지 결정할 것입니다. 우리는 또한 어떤 ISG15 단백질 표적이 그 효과를 중재할 수 있는지 확인할 것입니다.

UBP43 프로테아제 활성의 역할:

UBP43의 제거가 바이러스 복제를 감소시키거나 인터페론 반응을 확대하는 것으로 나타나면 UBP43의 억제가 HCV의 새로운 치료 수단이 될 것이라는 가설을 세웁니다. UBP43은 프로테아제 활성을 가지고 있기 때문에 특히 흥미로울 것입니다. 프로테아제는 소분자 요법에 대해 알려지고 검증된 표적입니다. 따라서 UBP43의 프로테아제 활성이 예를 들어 다른 세포 단백질과의 상호 작용이 아니라 HCV 복제에 미치는 영향에 중요한지 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 UBP43 프로테아제 비활성 구조물을 과발현할 것입니다. UBP43의 불활성 형태는 이전에 기술된 바와 같이 pBK/CMV-UBP43 플라스미드의 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 중요한 시스테인 잔기(Cys61)를 세린으로 돌연변이시킴으로써 생성될 것이다. UBP43의 프로테아제 활성 및 비활성 형태를 특성화하기 위해 야생형 및 돌연변이 UBP43은 발현 벡터 pGEX-4T-3(pGEX-4T-3-UBP43)에서 GST 융합 단백질로 발현되고 대장균으로 형질전환됩니다. ISG15-UBP43 융합 단백질을 발현하는 pET-ISG15-UBP43-H 플라스미드가 있는 BL21(DE3).35 융합 단백질로부터의 ISG15 절단은 웨스턴 블롯에 의해 나타날 것이다. 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 프로테아제 기능이 제거된다는 것이 확인되면 야생형 및 돌연변이 UBP43이 HCV 레플리콘이 있는 Huh7.5 세포에서 과발현되고 증가하는 IFNa 용량에 노출될 것입니다. 프로테아제 기능이 중요한 경우 비활성(우세한 음성 방식으로)의 과발현은 IFN에 대한 반응성을 증가시킬 것입니다.

ISG15의 단백질 표적:

흉선 조직을 사용한 이전 작업은 phospholipase Cg1, Jak1 및 ERK1을 포함하여 ISG15에 의한 ISGylation의 여러 표적을 확인했습니다. ERK와 JAK는 이전에 HCV 레플리콘 모델에서 항바이러스 효과와 관련이 있었지만 이들이 Huh7.5 세포의 표적인지 여부는 알려져 있지 않습니다. ISG15가 HCV 복제와 관련되어 있음을 발견하면 ISG15 변형에 대한 기질을 식별하려고 합니다. 우리는 먼저 이전에 ISG15에 의해 변형된 것으로 밝혀진 단백질에 대해 구체적으로 지시된 일련의 면역 침전 연구를 수행하고 감염된 세포와 감염되지 않은 세포의 차이점을 탐구할 것입니다. 요약하면, 12시간 동안 IFNa와 함께 Huh7.5 세포 +/- 레플리콘을 인큐베이션한 후, 세포는 RIPA 완충액에서 용해되고 위에서 사용된 항-ISG15 mAb로 수행된 ISG15 접합체의 면역침강이 될 것입니다. 환원 겔에 대한 분석 후 웨스턴 블롯을 수행하여 상업적으로 이용 가능한 mAb를 사용하여 위의 세 가지 표적이 ISG15에 의해 결합되는지 확인합니다. 표적의 일부 또는 전부가 접합된 경우 ISGylation의 결과를 밝히기 위해 추가 연구가 수행될 것입니다.

세포 배양에서 어떤 단백질이 ISG15로 변형되는지 더 자세히 알아보기 위해 이전에 유비퀴틴 유사 SUMO 단백질의 표적을 식별하는 데 사용된 전략을 적용하여 질량 분광법을 사용하여 보다 포괄적인 스크리닝을 수행할 것입니다. MALDI-TOF 질량 분석법과 결합된 TAP 태깅 접근법이 사용됩니다. TAP 태그 또는 SPA 태그 ISG15로 세포를 형질 감염시키고 IFN으로 처리하거나 처리하지 않은 세포에서 단백질 및 단백질 복합체를 정제합니다. 확립된 절차를 사용하여 겔 전기영동 및 질량 분석법을 사용하여 기질을 정제하고 식별합니다. 단백질을 포함하는 젤 슬라이스는 환원적으로 알킬화되고 트립시노분해됩니다. 펩티드는 Voyager DE-STR 장비(Applied Biosystems)에서 시아노-4-하이드록시신-남산 매트릭스를 사용하는 MALDI-TOF 질량 분석법으로 정제 및 분석됩니다. 이러한 대량 지문 데이터를 사용하여 단백질을 식별하는 것은 ProFound 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. MS는 단백질 양을 정량화하는 데 사용할 수 없기 때문에 다양한 조건에서 ISGylated 단백질 목록을 비교하여 관심 있는 단백질을 식별한 다음 웨스턴 블롯 연구를 수행하여 단백질 양을 비교합니다. 이러한 실험을 수행할 때 우리는 Best Institute에서 쉽게 구할 수 있는 MS 장비와 전문 지식을 사용할 것입니다.

결론 I: 종합하면 이들 연구는 IFN에 대한 HCV 레플리콘 반응에서 ISG15 및 UBP43 경로의 역할을 명확하게 정의하고 그 효과가 어떻게 중재되는지 제안할 것입니다. 중요한 것은 위에서 설명한 방법론이 ISG15 및 UBP43에 대해 자세히 설명되어 있지만 일반적이며 관심 있는 다른 후보 유전자에 적용될 수 있다는 것입니다.

섹션 II: 급성 C형 간염 바이러스 감염의 유전자 발현 프로파일링:

만성 질환에서 중요한 것으로 확인된 경로와 급성 감염에서 중요할 수 있는 경로에는 유사점이 있습니다. 예를 들어, 목록에 있는 유전자인 2'5'OAS의 다형성은 급성 감염에서 만성 감염으로의 진행 위험을 변경합니다.20 따라서 우리는 동일한 유전자 세트가 급성 감염을 제거하지 못하는 것을 결정하는 데 중요한 역할을 할 가능성이 있다고 가정합니다. 우리는 마이크로어레이 분석을 사용하여 이 가설을 테스트할 것입니다.

우리는 전신 및 국소 숙주/바이러스 상호작용 모두에서 급성 HCV 감염에서 이들 및 기타 유전자의 역할을 조사할 계획입니다. 급성으로 감염된 간 조직은 대부분의 급성 HCV 감염이 확인되지 않고 이러한 경우 간 생검을 수행하는 것이 부적절하기 때문에 얻기가 어렵습니다. 따라서 우리는 두 가지 접근 방식을 사용할 것입니다. 첫째, 급성 HCV를 앓고 있는 이집트 의료 종사자로부터 수집한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 유전자 발현 패턴(Sanaa Kamal 박사 제공)을 연구하고 이를 유전자형이 일치하는 만성 HCV 환자의 PBMC와 건강한 사람의 PBMC와 비교할 것입니다. 자원 봉사자. 우리는 어떤 유전자 하위 집합이 만성 감염의 확립과 같은 임상 결과와 가장 관련이 있는지 테스트하기 위한 예측 모델을 개발할 것입니다. 둘째, 이식 후 HCV의 재발을 생체 내 급성 간염의 모델로 사용할 것입니다. 우리는 이식 전에 기증자 간 생검을 한 다음 바이러스가 이식편을 감염함에 따라 시간이 지남에 따라 유전자 발현 수준을 따를 것입니다. 이식 후 HCV-나이브 간은 빠르고 보편적으로 HCV에 감염되지만, 환자의 70%만이 이식 후 3개월 및/또는 6개월에 실시한 간 생검에서 재발의 조직학적 증거를 나타냅니다. 현재 PegIFN/Rib를 사용하여 재발성 HCV를 치료하는 것은 바로 이러한 환자들입니다. 이전과 마찬가지로 유전자 하위 집합을 임상 결과와 연관시키는 예측 모델을 개발할 것입니다. 이식 후 더 심한 부작용에도 불구하고 치료 순응도를 높여 60% 이상의 반응률을 달성했습니다. 따라서 이식 전 HCV 치료의 경우 상당 부분의 환자가 치료에 반응하지 않고 병적 부작용에 불필요하게 노출됩니다. 우리가 고려할 주요 임상 결과는 PegIFN/Rib 치료에 대한 반응입니다. 관심 있는 또 다른 결과는 환자의 25-30%에서 5년 이내에 간경변증이 급속히 발생하고 이식 후 2년 이내에 7-9%에서 공격적인 섬유화 담즙정체 상태가 발생한다는 것입니다. 함께 이러한 데이터는 질병 지속 또는 제거(의료 종사자의 급성 HCV) 및 간 질환의 진행(이식 후 환자)을 초래하는 면역학적 반응에 중요한 유전자를 가리킬 것입니다. 고도로 상향 및 하향 조절된 유전자는 HCV 레플리콘 모델에서 추가로 연구될 것입니다.

연구 목적 2. 순환하는 면역 세포와 간에서 급성 간염의 임상 결과와 가장 관련성이 높은 유전자 발현 프로필을 결정합니다.

섹션 II에 대한 연구 프로토콜:

세 가지 주요 분석을 제안합니다. 첫째, 급성 HCV 환자로부터 Kamal 박사가 제공한 PBMC 제제에서 유전자 발현 프로파일링을 수행할 것입니다. 이러한 PBMC 준비는 Kamal 박사가 이끄는 진행 중인 연구의 일부로 수행되고 있습니다. 둘째, HCV 감염에 대한 반응으로 이식 후 간 이식편에서 HCV 감염에 의해 변경된 간 유전자를 설명하기 위해 마이크로어레이 분석을 사용할 것입니다. 이를 위해 일상적인 이식 후 임상 치료의 일부로 이미 수행되고 있는 간 생검의 일부를 사용할 것입니다. 셋째, 만성 HCV 환자로부터 PBMC를 준비하고 이를 통해 유전자 발현 프로파일을 결정합니다. 이들은 급성 HCV에 대한 중요한 비교일 뿐만 아니라 만성 HCV의 치료 결과를 예측하는 기준으로도 작용할 것입니다.

IIa. 환자 모집, 연구 모집단 및 샘플 및 데이터 수집:

모든 경우에 임상 직원은 환자를 연구의 잠재적 후보로 식별하고 연구 간호사가 접근합니다. 조직 및 혈액 샘플의 연구 사용과 환자 임상 데이터 수집에 대한 동의를 얻습니다.

급성 HCV: 전신 PBMC 반응 Dr. Kamal은 HCV에 급성으로 감염된 이집트 의료 종사자 집단을 추적하고 정기적으로 그들로부터 PBMC를 분리합니다. 이 임상 인구는 주로 유전자형 1 및 유전자형 4에 감염된 개인으로 구성되며 환자 인구 통계, 혈액 수집 시 RNA 역가 및 만성 감염으로의 진행에 대해 철저히 설명됩니다. 우리 지역 인구에서 유전자형 4형의 상대적 희소성을 고려할 때 초기 분석은 유전자형 1형 급성 HCV에 초점을 맞출 것이지만, 이 유전자형은 전 세계적으로 HCV와 큰 관련이 있기 때문에 유전자형 4형도 연구할 계획입니다. 우리의 이전 작업을 기반으로 우리는 임상적 다양성의 스펙트럼에 걸쳐 일관된 유전자 발현 변화를 명확하게 정의하기 위해 주어진 그룹에서 10-20명의 환자가 필요할 것으로 예상합니다. 우리는 연간 최소 20명의 급성 유전자형 1형 환자로부터 PBMC 샘플을 수집하고 연구할 것으로 예상합니다. 20명의 건강한 통제 지원자로부터의 샘플도 3년 연구 기간 동안 얻을 것입니다(포스터에 의해 모집됨).

급성 HCV: 이식 후 HCV 재발에 대한 간 반응 저희 센터에서는 매년 HCV에 감염된 사람에게 30-40건의 간 이식을 시행합니다. 간 이식 인구의 모든 임상 데이터는 Oracle 기반 데이터베이스에 입력됩니다. 간 생검은 이식 전과 이식 후 12주, 24주 및 52주에 HCV-나이브 이식편에서 일상적으로 수행됩니다. 이전 경험을 바탕으로 최소 80%의 적립률을 예상합니다. 따라서 연간 약 24-32명의 환자로부터 데이터와 표본을 수집할 수 있습니다. 살아있는 기증자 모집단(PI: I. McGilvray)에서 진행 중인 연구의 일부로 정상 간 생검을 수행합니다. 30-40 이러한 생검은 매년 수행되며 제어 간 조직의 독특한 소스를 나타냅니다.

만성 HCV: 전신 PBMC 반응 Dr. Heathcote는 만성 HCV 환자의 많은 집단을 추적합니다. PegIFN/Rib 치료를 고려 중인 환자로부터 혈액 샘플을 채취하고 PBMC를 분리합니다. 위의 진행 보고서에 요약된 간 생검 연구의 경험을 바탕으로 매년 최소 50명의 환자로부터 PBMC 제제를 확보할 것으로 예상합니다. 이 중 약 2/3가 유전자형 1형 환자입니다.

IIb. 데이터 분석:

급성 HCV: 순환하는 PBMC에서 급성 HCV에 반응하는 유전자 발현 변화 급성 유전자형 1형 HCV 환자의 PBMC로부터의 유전자 발현 프로필을 결정하고 정상적인 건강한 대조군 및 만성 유전자형 1형 HCV로부터의 프로필과 비교할 것입니다. 유전자는 그룹 간의 통계 및 배수 차이(p 값 <0.01, 배수 변화 최소 1.5)로 확인됩니다. 이 비교는 어떤 유전자 발현 변경이 급성 HCV 감염에 특이적인지를 정의합니다. 개별 유전자를 만성 질환으로의 진행과 연관시키기 위해 급성 감염된 개인의 유전자 발현을 만성 감염으로 진행한 사람과 자발적으로 바이러스를 제거한 사람 사이에서 비교하는 하위 그룹 분석이 수행됩니다. 이러한 유전자의 실시간 PCR 확인 후 만성 감염이 진행되는 환자를 정확하게 분류하는 예측 유전자 세트를 개발하기 위해 감독되지 않은(계층적 클러스터링, 주요 구성 요소) 및 감독된(가장 가까운 이웃, 선형 판별) 분석을 사용할 것입니다. 이러한 결과를 종합하면 급성 HCV에 대한 전신 면역학적 반응에서 발현이 변경된 유전자와 이것이 만성 질환의 확립과 어떻게 관련되는지 확인할 수 있습니다. 가능한 치료 표적으로서 관심 있는 유전자는 앞에서 설명한 바와 같이 HCV 레플리콘 모델을 사용하여 추가로 연구할 것입니다. 연구 2년차 말까지 우리는 40명의 급성 유전자형 1형 환자를 분석할 것으로 예상하고, 3년차에는 20명의 유전자형 4형 환자를 분석할 것입니다.

급성 HCV: 이식 후 HCV 감염에서의 국소 간 유전자 발현 유전자 발현 프로파일은 장기 회수 시, HCV에 의한 감염 전 및 이식 후 3, 6 및 12개월에 간 생검으로부터 결정될 것이다. 따라서 유전자 변화는 동일한 환자에서 그리고 환자 간에 추적될 수 있습니다. 유전자 수준은 우리 연구실과 EBI에서 개발된 통계적 방법을 사용하여 정상 간 조직 및 HCV 순진한 이식편의 기준선 유전자 발현과 비교됩니다. 현재 저희 센터에서 HCV를 이식받은 환자의 70%는 간 생검에서 재발성 HCV 소견이 나타난 후 이식 후 재발성 HCV 치료를 받고 있으며, 이 환자들에서 정량적 HCV 역가는 이식 후 3개월 또는 6개월에 수행됩니다. 약 80%의 환자가 12개월 과정에 걸쳐 치료를 완료합니다. 따라서 3년 연구가 끝날 때까지 우리는 28-36명의 환자의 치료에 대한 반응을 알게 될 것이며(우리는 60%의 반응률을 예상하므로 대략 17-22명의 반응자와 11-14명의 비반응자) 결국 데이터를 갖게 될 것입니다. 치료를 완료할 것으로 예상되는 42-54명의 환자에 대해. 이 샘플 크기로 우리는 어떤 유전자 하위 집합이 치료에 대한 반응을 예측하는지 결정할 수 있습니다(위에 언급된 방법 사용). 마찬가지로 우리는 50-60명의 환자에서 유전자 발현을 HCV RNA 역가와 연관시킬 수 있습니다. 3년 연구가 끝날 때까지 우리는 72~90명의 환자에 대한 임상 및 게놈 데이터를 갖게 될 것입니다. 궁극적으로 우리는 유전자 발현을 재발성 간경변의 발달과 연관시킬 것이며 대략 18-30명의 환자가 이식 후 5년 이내에 이 상태가 될 것으로 예상합니다. 이식 후 간 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 많은 교란 요인(예: 급성 거부반응, 면역 억제) 광범위한 임상 데이터베이스를 사용하여 하위 그룹 분석을 수행합니다. 우리는 만성 HCV에 대해 이미 결정된 것과 급성 간 HCV의 유전자 발현 프로파일을 비교하는 것 외에도 HCV 치료 반응자와 비반응자, 거부반응과 무반응, 다른 면역억제 요법을 비교할 것입니다. 이러한 분석을 통해 간 유전자 발현에 대한 급성 HCV 감염의 영향을 구별하고 설명할 수 있습니다.

만성 HCV: 순환 PBMC 반응 및 치료 결과 예측:

우리 연구의 첫 2년 동안 만성 유전자형 1형 HCV 환자 약 30명의 PBMC를 연구하기 위해 유전자 발현 프로파일링을 사용할 것입니다. 이 데이터는 PBMC의 급성 HCV 연구에 중요한 통제 역할을 할 것입니다. 그러나 이러한 모든 샘플은 PegIFN/Rib로 치료를 계속할 환자에게서 채취합니다. 따라서 우리는 급성 감염된 PBMC와의 비교뿐만 아니라 치료 결과를 예측하는 유전자 하위 집합을 결정하기 위해 이러한 연구의 유전자 발현 데이터를 사용할 것입니다. 이러한 결과는 비침습적 예후 검사의 기초가 될 것입니다.

결론 II: 이 연구는 전신 및 국소 수준에서 급성 HCV 감염에 수반되는 유전자 발현 변화에 대한 포괄적인 설명을 제공할 것입니다. 그들은 만성 질환으로의 진행과 불리한 임상 결과에 중요한 유전자를 명확하게 식별하여 새로운 예후 및 치료 목표를 제시할 것입니다.