Diagnose af almindelige orale sygdomme ved signaturflygtige profiler

Læger i det antikke Grækenland forstod, at det at lugte til deres patienters ånde kan hjælpe med at diagnosticere. Men selvom denne ret primitive diagnostiske metode ikke har ændret sig meget gennem århundreder, har der i de senere år været en stigende interesse for at forbedre metoder til ikke-invasiv tidlig diagnose for talrige metaboliske og infektionssygdomme.

I øjeblikket savnes og forværres mange sygdomme på grund af forsinket diagnose. Inden for tandmedicin har patienterne en tendens til at undgå at besøge deres tandlæge selv for regelmæssige undersøgelser, og de optræder derfor først på klinikken på et senere, fremskredent stadium af sygdommen, lider af smerter og ubehag, der let kunne have været forhindret, og viser sig i et sent stadium. sygdom, hvilket bringer behandlingsresultatet i fare.

Af disse grunde er der et presserende behov for en billig og minimalt invasiv teknologi, der kan tjene som en diagnostisk hjælp, der muliggør 1) effektiv tidlig detektion og 2) behandlingstilpasning.

Diagnostiske modaliteter baseret på påvisning af flygtige organiske forbindelser (fremover VOC), dvs. organiske forbindelser med relativt højt damptryk ved stuetemperatur, kan være svaret på det førnævnte behov.

"Elektroniske næser" til påvisning af flygtige organiske forbindelser i udåndingsluften Sygdomsspecifikke flygtige organiske forbindelser produceres hovedsageligt gennem ændringer i specifikke biokemiske veje i kroppen. Efter deres produktion af enten menneskelige eller bakterielle celler, kan VOC findes i kropsvæsker, herunder inficerede celler og/eller deres mikromiljø, blod, åndedræt og spyt, blandt andre. VOC'er frigivet fra deres oprindelse kan således påvises direkte fra blod og cellernes headspace.

Adskillige verdensomspændende forskningsgrupper undersøger muligheden for ikke-invasiv VOC-detektion i udåndingsluften, hvilket muliggør diagnosticering af forskellige systemiske sygdomme6, herunder carcinomer (lunge, bryst og kolorektal), tuberkulose, nyresvigt og astma. De VOC'er, der er tale om, er alkaner (C4-C20), methylalkener og benzenderivater, der findes hos raske individer i koncentrationer på 1-20ppb (part per milliard), mens koncentrationen af ​​sygdomsspecifikke VOC'er ved sygdom øges. VOC'er foreslås produceret af det nødstedte væv på grund af oxidativt stress, af leveren som en del af en metabolisk reaktion eller af immunsystemet.

En "elektronisk næse" er en enhed, der er i stand til at genkende den flygtige sammensætning af en luftprøve. Enheden består af en række nanoreceptorer, der er i stand til at omdanne fysisk eller kemisk information til et elektrisk signal. Hver receptor i arrayet reagerer forskelligt på materialerne i den analyserede prøve, og kombinationen af ​​disse responser fra flere receptorer producerer en unik flygtig profil, der kan skelnes ved kvalitet (nemlig hvilke molekyler findes i prøven?) og kvantitet (nemlig, hvad er den nøjagtige koncentration af hvert molekyle?).

Et elektronisk næsesystem til luftprøveanalyse bør normalt bestå af tre nøglekomponenter:

1. Ånde-/headspace-opsamlingsenhed
2. Bearbejdningsenhed
3. Klassifikationsalgoritme. De første og mest udbredte sådanne enheder er baseret på luftprøveanalyse i et gaskromatografi/massespektrometri (GC-MS) system. Avancerede systemer omfatter methyloxidsensorer (MOS) eller nanoreceptorer.

Et nanoreceptor-baseret elektronisk næsesystem (NaNose) er ved at blive udviklet på laboratoriet for co-PI (Prof. Haick, Fakultet for Kemiteknik, Technion, Haifa, Israel), i stand til at påvise spor af VOC'er i koncentrationer af enkeltdele pr. milliard (1 µg/l). Parret med et computerstyret system, der er i stand til at analysere store mængder data fra hundredvis af molekyler, detekteret samtidigt af en række af 20 eller flere receptorer, overgår dette system de andre "elektroniske næse"-enheder med hensyn til følsomhed og effektivitet. I modsætning til dyre og langsomme GC-MS-systemer bør en ideel nanomateriale-baseret sensor til udåndingstest være følsom ved meget lave koncentrationer af flygtige organiske forbindelser, selv i nærvær af miljømæssige eller fysiologiske forstyrrende faktorer. Det bør også reagere hurtigt og forholdsmæssigt på små ændringer i koncentrationen og give et ensartet output, der er specifikt for en given forbindelse. Når den ikke er i kontakt med de pågældende forbindelser, bør sensoren hurtigt vende tilbage til sin baseline-tilstand eller være enkel og billig nok til at kunne bruges til engangsbrug.

Luftprøvetagning med sådanne receptorer bør være sammenlignelig enkel, og dens resultater kan fortolkes automatisk, hvilket gør den velegnet til omkostningseffektiv screening af en stor population. Kun positivt testede patienter vil kræve konventionel og ubehagelig diagnostik for at bekræfte den tidlige diagnose, før en behandling foreslås.

Ikke desto mindre har alle eksisterende VOC-baserede diagnostiske modaliteter en tendens til at glemme, at udåndingsluften er en kombination af adskillige oprindelser - lunger, den øvre mave-tarmkanal og mundhulen med en lille næsekomponent. Mens sammensætningen og flygtige profiler af luft fra lungerne blev grundigt undersøgt i det seneste årti, som et middel til at finde en tidlig diagnostisk tilgang til kræft10,15, forblev den orale komponent stort set uberørt.

Mikronicher i mundhulen hos raske individer rummer biofilm, der kan indeholde over 1000 forskellige bakteriearter. I mangel af aktiv mekanisk eller kemisk rensning akkumuleres biofilm, ændres og modnes, hvilket forårsager bløddelsbetændelse, kendt som gingivitis. Hos nogle individer og under visse forhold udvikler betændelse sig til periodontal sygdom, og biofilmsammensætningen ændres til en højere andel af anaerobe gramnegative bakterier med øget virulens og evne til at bryde væv. Bortset fra biofilmmikroorganismer kan yderligere kilder til VOC'er i mundhulen omfatte serum, tandkødsekssudat, betændt tandkødsvæv, sår og læsioner, patologier forbundet med spytkirtler, bihuler og næsehule, gastrointestinal refluks, interdentalt fanget madrester og miljøforurening . Hertel et al. har for nylig rapporteret om unikke flygtige profiler i headspace af specifikke orale bakterier og svampe.

Vi antager, at nanoreceptor-baserede volatolomics kan bruges som en diagnostisk modalitet til ikke-invasiv tidlig diagnose af orale sygdomme, baseret på en prøve af udåndet luft.

Den foreslåede forskning har til formål at lægge grundlaget for en hurtig, brugervenlig og ikke-invasiv diagnostisk modalitet for almindelige orale sygdomme i udåndingsluftprøver baseret på NaNose. Dette vil i en overskuelig fremtid tjene som en base for skabelsen af ​​et salgbart klinisk eller hjemmebaseret diagnostisk udstyr.

Specifikke mål:

1. Påvisning og analyse af VOC'er forbundet med almindelige orale sygdomme i headspaces af mikroorganismeprøver fra mundhulerne hos patienter diagnosticeret med tandkødsbetændelse, parodontale sygdomme eller caries og sammenlignet med en kontrolgruppe af raske patienter.
2. Karakterisering af flygtige profiler for almindelige orale sygdomme og definering af specificerede diagnostiske nanoreceptorer.

Ønskede resultater

1. Resultaterne af den foreslåede forskning kan føre til en revolution blandt tandlæger såvel som hjemmeplejen. Til dato er den eneste måde for en person at lære om sin orale tilstand at planlægge en aftale med en tandlæge, men alligevel undgår en betydelig del af befolkningen regelmæssige kontroller og behandling. Et nemt værktøj, der muliggør en enkel og ikke-invasiv luftprøvetagning i hjemmet eller i et apotek, vil øge patienternes compliance og helbredelsesrater betydeligt og reducere sundhedsudgifterne.
2. VOC-kortlægning af luften med oprindelse i mundhulen kan øge den diagnostiske værdi af luftprøver med oprindelse i lungerne og dermed forbedre præcisionen, følsomheden og specificiteten af ​​ikke-invasiv tidlig diagnose af cancer, nyresvigt og andre indre sygdomme.

Metoder

Trin 1 - Påvisning og analyse af VOC'er forbundet med almindelige orale sygdomme. Kendte bakteriestammer (Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Acinetobacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Lactobacillus vil separat indeholde acidophilused i seacocultivused) indsamling og analyse af det unikke headspace inde i flaskerne. Efter dyrkning vil headspace blive opsamlet i et Tenax absorberende rør (Sigma-Aldrich, 28718-U SUPELCOTenax® TA / Carboxen® 1018) og analyseret i GC-MS (gaschromatografi-massespektrometri). En unik flygtig profil af hver bakteriestamme vil blive bestemt via en statistisk analyse. Den komplette forsøgsprotokol er tilgængelig i tillæg 1 nedenfor.

Tre (3) gentagelser vil blive udført med hver stamme.

Trin 2 - Karakterisering af flygtige profiler for almindelige orale sygdomme og definering af specificerede diagnostiske nanoreceptorer De testede prøver vil være af oral bakteriel plak og inficeret dentin, dyrket i forseglede flasker svarende til trin 1.

Patienterne kommer fra de studerendes klinikker, og prøverne vil blive udtaget som led i deres tandbehandling, nemlig: fjernelse af caries og inficeret dentin til fremtidig restaurering samt tandsten og plakfjernelse til behandling af paradentose.

1. I begyndelsen af ​​behandlingssessionen indhentes et informeret samtykke fra patienten, der accepterer brugen af ​​fjernet plak/inficeret dentin i forskning. Der forventes ingen afvigelse fra standardbehandlingsprotokollen.

   1. Plaqueprøven fra parodontale patienter vil blive taget, før grov skældannelse er påbegyndt, med et manuelt værktøj (Gracey 5-6 curette), fra det cervikale område af underkæbefortænderne.
   2. Den inficerede dentinprøve af kariestænder vil blive taget med et manuelt værktøj (Spoon Excavator), efter at den oprindelige form af det forberedte hulrum blev skitseret.
2. De indsamlede prøver vil derefter blive dyrket i forseglede flasker indeholdende Wilkins-Chalgren-medium ved 37°C i 48 timer, svarende til trin 1 ovenfor. En flaske med sterilt medium vil blive brugt som kontrol.
3. Headspace vil derefter blive indsamlet og analyseret på samme måde som punkt 5-8 i fase 1 ovenfor.
4. På dette tidspunkt vil den unikke flygtige profil for hver patient blive forbundet med hans kliniske diagnose (omfanget af periodontal sygdom/caries) og analyseret for statistisk konsistens.
5. Data indsamlet i trin 1-2 vil blive statistisk analyseret som en helhed.