Diagnóstico de doenças bucais comuns por perfis voláteis de assinatura

Os médicos da Grécia antiga entendiam que cheirar o hálito de seus pacientes pode ajudar no diagnóstico. No entanto, embora esse método de diagnóstico bastante primitivo não tenha mudado muito ao longo dos séculos, tem havido um interesse crescente nos últimos anos em melhorar os métodos de diagnóstico precoce não invasivo para inúmeras doenças metabólicas e infecciosas.

Atualmente, muitas doenças passam despercebidas e se agravam devido ao atraso no diagnóstico. Na medicina dentária, os pacientes tendem a evitar ir ao dentista mesmo para exames regulares e, assim, só aparecem na clínica numa fase avançada e tardia da doença, com dores e desconfortos que poderiam facilmente ser evitados, apresentando-se numa fase tardia doença, comprometendo o resultado do tratamento.

Por esses motivos, há uma necessidade urgente de uma tecnologia barata e minimamente invasiva que sirva como auxílio diagnóstico, permitindo 1) detecção precoce eficiente e 2) personalização do tratamento.

Modalidades de diagnóstico baseadas na detecção de compostos orgânicos voláteis (doravante VOCs), ou seja, compostos orgânicos com pressão de vapor relativamente alta à temperatura ambiente, podem ser a resposta para a necessidade mencionada.

"Narizes Eletrônicos" para a Detecção de Compostos Orgânicos Voláteis no Ar Exalado Compostos orgânicos voláteis específicos para doenças são produzidos principalmente através de mudanças em vias bioquímicas específicas no corpo. Após sua produção por células humanas ou bacterianas, os VOCs podem ser encontrados em fluidos corporais, incluindo células infectadas e/ou seu microambiente, sangue, respiração e saliva, entre outros. Assim, os VOCs liberados de sua origem podem ser detectados diretamente no sangue e no headspace das células.

Numerosos grupos de pesquisa em todo o mundo estão investigando a possibilidade de detecção não invasiva de VOC no ar expirado, possibilitando o diagnóstico de várias doenças sistêmicas6, incluindo carcinomas (pulmão, mama e colorretal), tuberculose, insuficiência renal e asma. Os VOCs em questão são alcanos (C4-C20), metil-alcenos e derivados de benzeno, encontrados em indivíduos saudáveis ​​em concentrações de 1-20ppb (parte por bilhão), enquanto na doença, a concentração de VOCs específicos da doença é aumentada. Sugere-se que os VOCs sejam produzidos pelo tecido danificado devido ao estresse oxidativo, pelo fígado como parte de uma reação metabólica ou pelo sistema imunológico.

Um "Nariz Eletrônico" é um dispositivo capaz de reconhecer a composição volátil de uma amostra de ar. O dispositivo consiste em um conjunto de nanorreceptores capazes de transformar informações físicas ou químicas em um sinal elétrico. Cada receptor na matriz reage de maneira diferente aos materiais na amostra analisada, e a combinação dessas respostas de vários receptores produz um perfil volátil único, distinguível pela qualidade (ou seja, quais moléculas são encontradas na amostra?) qual é a concentração exata de cada molécula?).

Um sistema de nariz eletrônico para análise de amostras de ar geralmente consiste em três componentes principais:

1. Dispositivo de coleta de respiração/headspace
2. Dispositivo de processamento
3. Algoritmo de classificação. Os primeiros e mais difundidos tais dispositivos são baseados na análise de amostras de ar em um sistema de cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GC-MS). Sistemas avançados incluem sensores de óxido de metila (MOS) ou nanorreceptores.

Um sistema de nariz eletrônico baseado em nanorreceptores (NaNose) está sendo desenvolvido, no Laboratório do co-PI (Prof. Haick, Faculdade de Engenharia Química, Technion, Haifa, Israel), capaz de detectar vestígios de VOCs em concentrações de partes por bilhão (1µg/l). Emparelhado com um sistema computadorizado capaz de analisar grandes quantidades de dados de centenas de moléculas, detectadas simultaneamente por uma matriz de 20 ou mais receptores, esse sistema supera os outros dispositivos de "nariz eletrônico" em termos de sensibilidade e eficiência. Ao contrário dos sistemas GC-MS caros e lentos, um sensor baseado em nanomateriais ideal para teste respiratório deve ser sensível a concentrações muito baixas de compostos orgânicos voláteis, mesmo na presença de fatores de confusão ambientais ou fisiológicos. Ele também deve responder rápida e proporcionalmente a pequenas mudanças na concentração e fornecer uma saída consistente específica para um determinado composto. Quando não estiver em contato com os compostos em questão, o sensor deve retornar rapidamente ao seu estado inicial ou ser simples e barato o suficiente para ser descartável.

A amostragem de ar com tais receptores deve ser comparativamente simples e seus resultados podem ser interpretados automaticamente, o que o torna adequado para triagem econômica de grandes populações. Somente pacientes testados positivamente necessitarão de diagnósticos convencionais e desagradáveis ​​para confirmar o diagnóstico precoce, antes que um tratamento seja sugerido.

No entanto, todas as modalidades de diagnóstico baseadas em VOC existentes tendem a esquecer que o ar exalado é uma combinação de várias origens - pulmões, trato GI superior e cavidade oral com pequeno componente nasal. Embora a composição e os perfis voláteis do ar dos pulmões tenham sido exaustivamente pesquisados ​​na última década, como meio de encontrar uma abordagem de diagnóstico precoce para o câncer10,15, o componente oral permaneceu praticamente intocado.

Micro nichos na cavidade oral de indivíduos saudáveis ​​abrigam biofilme que pode conter mais de 1000 espécies diferentes de bactérias. Na ausência de limpeza mecânica ou química ativa, o biofilme se acumula, muda e amadurece, causando inflamação dos tecidos moles, conhecida como gengivite. Em alguns indivíduos e sob certas condições, a inflamação progride para doença periodontal, e a composição do biofilme muda para uma maior proporção de bactérias anaeróbias Gram-negativas com maior virulência e capacidade de quebra de tecidos. Além dos microrganismos do biofilme, fontes adicionais de VOCs na cavidade oral podem incluir soro, exsudato gengival, tecido gengival inflamado, feridas e lesões, patologias associadas a glândulas salivares, seios nasais e cavidade nasal, refluxo gastrointestinal, restos de comida interdental presos e poluição ambiental . Hertel et ai. relatou recentemente perfis voláteis únicos no espaço livre de bactérias e fungos orais específicos.

Nossa hipótese é que a volatômica baseada em nanorreceptores pode ser usada como uma modalidade diagnóstica para o diagnóstico precoce não invasivo de doenças bucais, com base em uma amostra de ar exalado.

A pesquisa proposta visa estabelecer as bases para uma modalidade de diagnóstico rápida, fácil de usar e não invasiva para doenças bucais comuns em amostras de ar exalado, com base no NaNose. Isso servirá em um futuro previsível como base para a criação de um dispositivo de diagnóstico clínico ou doméstico comercializável.

Objetivos específicos:

1. Detecção e análise de VOCs relacionados com doenças bucais comuns nos espaços de cabeça de amostras de microorganismos das cavidades orais de pacientes diagnosticados com gengivite, doenças periodontais ou cárie, e comparados a um grupo controle de pacientes saudáveis.
2. Caracterização de perfis voláteis para doenças bucais comuns e definição de nanorreceptores diagnósticos específicos.

Resultados desejados

1. Os resultados da pesquisa proposta podem levar a uma revolução entre os profissionais da odontologia, assim como no atendimento domiciliar. Até hoje, a única maneira de um indivíduo saber de sua condição bucal é agendar uma consulta com um dentista, mas uma parcela significativa da população evita exames e tratamentos regulares. Uma ferramenta fácil que permite uma amostragem de ar simples e não invasiva em casa ou em uma farmácia aumentará significativamente as taxas de adesão e curabilidade do paciente e diminuirá os gastos com saúde.
2. O mapeamento VOC do ar originário da cavidade oral pode aumentar o valor diagnóstico de amostras de ar originárias dos pulmões, melhorando assim a precisão, sensibilidade e especificidade do diagnóstico precoce não invasivo de câncer, insuficiência renal e outras doenças internas.

Métodos

Fase 1 - Detecção e análise de VOCs relacionados com doenças orais comuns Cepas bacterianas conhecidas (Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Acinetobacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Lactobacillus acidophilus) serão cultivadas separadamente em frascos selados contendo meios apropriados, permitindo coleta e análise do headspace exclusivo dentro das garrafas. Após o cultivo, o headspace será coletado em um tubo absorvente Tenax (Sigma-Aldrich, 28718-U SUPELCOTenax® TA / Carboxen® 1018) e analisado em GC-MS (Gas Chromatography- Mass Spectrometry). Um perfil volátil único de cada cepa bacteriana será determinado por meio de uma análise estatística. O protocolo completo do estudo está disponível no Adendo 1 abaixo.

Três (3) repetições serão realizadas com cada esforço.

Fase 2 - Caracterização de perfis voláteis para doenças bucais comuns e definição de nanorreceptores diagnósticos especificados

Os pacientes terão origem nas clínicas dos alunos, e as amostras serão recolhidas no âmbito do seu tratamento dentário, nomeadamente: remoção de cárie e dentina infectada para futura restauração, e remoção de cálculo e placa dentária para tratamento de doença periodontal.

1. No início da sessão de tratamento, será obtido um consentimento informado do paciente, concordando com o uso de placa removida/dentina infectada em pesquisa. Nenhum desvio do protocolo de tratamento padrão é esperado.

   1. A amostra de placa de pacientes periodontais será coletada antes do início da raspagem grosseira, com uma ferramenta manual (cureta Gracey 5-6), da área cervical dos incisivos inferiores.
   2. A amostra de dentina infectada de dentes cariados será retirada com uma ferramenta manual (Spoon Excavator), após a forma inicial da cavidade preparada ter sido delineada.
2. As amostras coletadas serão então cultivadas em frascos lacrados contendo meio Wilkins-Chalgren, a 37°C por 48 horas, de forma semelhante à Etapa 1 acima. Um frasco com meio estéril será utilizado como controle.
3. O headspace será então coletado e analisado de forma semelhante aos pontos 5-8 no Estágio 1 acima.
4. Neste ponto, o perfil volátil único de cada paciente será vinculado ao seu diagnóstico clínico (extensão da doença periodontal/cárie) e analisado quanto à consistência estatística.
5. Os dados coletados nas etapas 1-2 serão analisados ​​estatisticamente como um todo.