Diagnose van veel voorkomende mondaandoeningen door kenmerkende vluchtige profielen

Artsen in het oude Griekenland begrepen dat het ruiken van de adem van hun patiënten kan helpen bij de diagnose. Hoewel deze nogal primitieve diagnostische methode in de loop van de eeuwen niet veel is veranderd, is er de laatste jaren een toenemende belangstelling voor het verbeteren van methoden voor niet-invasieve vroege diagnose van tal van metabole en infectieziekten.

Momenteel worden veel ziekten over het hoofd gezien en verergerd door een vertraagde diagnose. In de tandheelkunde hebben patiënten de neiging om hun tandarts niet te bezoeken, zelfs niet voor regelmatige controles, en dus verschijnen ze pas in de kliniek in een later, vergevorderd stadium van de ziekte, lijdend aan pijn en ongemak die gemakkelijk voorkomen hadden kunnen worden, en presenteren ze zich in een laat stadium van de ziekte. ziekte, waardoor het behandelresultaat in gevaar komt.

Om deze reden is er dringend behoefte aan een goedkope en minimaal invasieve technologie die zou kunnen dienen als diagnostisch hulpmiddel, waardoor 1) efficiënte vroege opsporing en 2) behandeling op maat mogelijk is.

Diagnostische modaliteiten gebaseerd op de detectie van vluchtige organische stoffen (hierna VOC's), d.w.z. organische verbindingen met een relatief hoge dampdruk bij kamertemperatuur, kunnen het antwoord zijn op de bovengenoemde behoefte.

"Elektronische neuzen" voor de detectie van vluchtige organische stoffen in de uitgeademde lucht Ziektespecifieke vluchtige organische stoffen worden voornamelijk geproduceerd door veranderingen in specifieke biochemische routes in het lichaam. Na hun productie door menselijke of bacteriële cellen, kunnen VOC's onder andere worden aangetroffen in lichaamsvloeistoffen, waaronder geïnfecteerde cellen en/of hun micro-omgeving, bloed, adem en speeksel. VOC's die vrijkomen uit hun oorsprong kunnen dus rechtstreeks worden gedetecteerd uit bloed en de vrije ruimte van cellen.

Talrijke wereldwijde onderzoeksgroepen onderzoeken de mogelijkheid van niet-invasieve VOC-detectie in de uitgeademde lucht, waardoor de diagnose van verschillende systemische ziekten6 mogelijk wordt, waaronder carcinomen (long-, borst- en colorectaal), tuberculose, nierfalen en astma. De VOS in kwestie zijn alkanen (C4-C20), methylalkenen en benzeenderivaten, die bij gezonde personen worden aangetroffen in concentraties van 1-20 ppb (part per million), terwijl bij ziekte de concentratie van ziektespecifieke VOS verhoogd is. Er wordt gesuggereerd dat VOC's worden geproduceerd door het noodlijdende weefsel als gevolg van oxidatieve stress, door de lever als onderdeel van een metabolische reactie of door het immuunsysteem.

Een "elektronische neus" is een apparaat dat in staat is om de vluchtige samenstelling van een luchtmonster te herkennen. Het apparaat bestaat uit een reeks nanoreceptoren die in staat zijn om fysische of chemische informatie om te zetten in een elektrisch signaal. Elke receptor in de array reageert anders op de materialen in het geanalyseerde monster, en de combinatie van deze reacties van verschillende receptoren produceert een uniek vluchtig profiel, te onderscheiden door kwaliteit (namelijk, welke moleculen worden in het monster gevonden?) en kwantiteit (namelijk, wat is de exacte concentratie van elk molecuul?).

Een elektronisch neussysteem voor de analyse van luchtmonsters bestaat gewoonlijk uit drie hoofdcomponenten:

1. Apparaat voor het verzamelen van adem / hoofdruimte
2. Verwerkend apparaat
3. Classificatie algoritme. De eerste en meest voorkomende dergelijke apparaten zijn gebaseerd op luchtmonsteranalyse in een gaschromatografie / massaspectrometrie (GC-MS) -systeem. Geavanceerde systemen omvatten methyloxidesensoren (MOS) of nanoreceptoren.

Op het laboratorium van de co-PI (Prof. Haick, Faculteit Chemische Technologie, Technion, Haifa, Israël), in staat om sporen van VOC's te detecteren in concentraties van enkele delen per miljard (1 µg/l). In combinatie met een geautomatiseerd systeem dat grote hoeveelheden gegevens van honderden moleculen kan analyseren, die gelijktijdig worden gedetecteerd door een reeks van 20 of meer receptoren, overtreft dit systeem de andere "elektronische neus" -apparaten in termen van gevoeligheid en efficiëntie. In tegenstelling tot dure en trage GC-MS-systemen, zou een ideale op nanomateriaal gebaseerde sensor voor ademtesten gevoelig moeten zijn bij zeer lage concentraties vluchtige organische stoffen, zelfs in de aanwezigheid van omgevings- of fysiologische verstorende factoren. Het moet ook snel en proportioneel reageren op kleine concentratieveranderingen en een consistente output leveren die specifiek is voor een bepaalde verbinding. Wanneer de sensor niet in contact komt met de verbindingen in kwestie, moet hij snel terugkeren naar zijn basistoestand, of eenvoudig en goedkoop genoeg zijn om wegwerpbaar te zijn.

Luchtbemonstering met dergelijke receptoren zou vergelijkbaar eenvoudig moeten zijn en de resultaten kunnen automatisch worden geïnterpreteerd, wat het geschikt maakt voor kosteneffectieve screening van grote populaties. Alleen positief geteste patiënten zullen conventionele en onaangename diagnostiek nodig hebben om de vroege diagnose te bevestigen, voordat een behandeling wordt voorgesteld.

Desalniettemin hebben alle bestaande op VOS gebaseerde diagnostische modaliteiten de neiging om te vergeten dat de uitgeademde lucht een combinatie is van talrijke oorsprongen - longen, het bovenste deel van het maagdarmkanaal en de mondholte met een kleine neuscomponent. Hoewel de samenstelling en vluchtige profielen van lucht uit de longen de afgelopen tien jaar grondig zijn onderzocht, als middel om een ​​vroege diagnostische benadering van kanker te vinden10,15, bleef de orale component grotendeels onaangeroerd.

Micro-niches in de mondholte van de biofilm van gezonde individuen die meer dan 1000 verschillende bacteriesoorten kunnen bevatten. Bij afwezigheid van actieve mechanische of chemische reiniging hoopt de biofilm zich op, verandert en rijpt, waardoor ontsteking van zacht weefsel ontstaat, bekend als gingivitis. Bij sommige personen en onder bepaalde omstandigheden ontwikkelt de ontsteking zich tot parodontitis en verandert de samenstelling van de biofilm in een groter aandeel anaerobe gramnegatieve bacteriën met verhoogde virulentie en weefselafbrekend vermogen. Afgezien van biofilm-micro-organismen, kunnen aanvullende bronnen van VOS in de mondholte zijn: serum, exsudaat van het tandvlees, ontstoken tandvlees, zweren en laesies, pathologieën geassocieerd met speekselklieren, sinussen en neusholte, gastro-intestinale reflux, interdentaal opgesloten voedselresten en milieuverontreinigende stoffen . Hertel et al. heeft onlangs melding gemaakt van unieke vluchtige profielen in de headspace van specifieke orale bacteriën en schimmels.

Onze hypothese is dat op nanoreceptoren gebaseerde volatolomics kunnen worden gebruikt als diagnostische modaliteit voor niet-invasieve vroege diagnose van orale ziekten, gebaseerd op een monster uitgeademde lucht.

Het voorgestelde onderzoek beoogt de basis te leggen voor een snelle, gebruiksvriendelijke en niet-invasieve diagnostische modaliteit voor veelvoorkomende mondziekten in uitgeademde luchtmonsters, gebaseerd op de NaNose. Dit zal in de nabije toekomst dienen als basis voor het creëren van een verhandelbaar klinisch of thuisgebaseerd diagnostisch apparaat.

Specifieke doelen:

1. Detectie en analyse van VOC's die verband houden met veelvoorkomende mondziekten in de headspaces van monsters van micro-organismen uit de mondholten van patiënten met de diagnose gingivitis, parodontitis of cariës, en vergeleken met een controlegroep van gezonde patiënten.
2. Karakterisering van vluchtige profielen voor veelvoorkomende mondziekten en definitie van gespecificeerde diagnostische nanoreceptoren.

Gewenste resultaten

1. De resultaten van het voorgestelde onderzoek kunnen leiden tot een revolutie onder tandheelkundige professionals, maar ook in de thuiszorg. Tot op heden is een afspraak met een tandarts de enige manier voor een persoon om te weten te komen over zijn mondaandoening, maar toch vermijdt een aanzienlijk deel van de bevolking regelmatige controles en behandelingen. Een eenvoudig hulpmiddel dat een eenvoudige en niet-invasieve luchtbemonstering thuis of in een drogisterij mogelijk maakt, zal de therapietrouw en genezingspercentages van de patiënt aanzienlijk verhogen en de zorgkosten verlagen.
2. VOC-kartering van de lucht afkomstig uit de mondholte kan de diagnostische waarde van luchtmonsters afkomstig uit de longen verhogen, waardoor de precisie, gevoeligheid en specificiteit van niet-invasieve vroege diagnose van kanker, nierfalen en andere inwendige ziekten wordt verbeterd.

methoden

Fase 1 - Detectie en analyse van VOC's die verband houden met veel voorkomende mondziekten. Bekende bacteriestammen (Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Acinetobacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Lactobacillus acidophilus) zullen afzonderlijk worden gekweekt in afgesloten flessen met de juiste media, waardoor verzameling en analyse van de unieke vrije ruimte in de flessen. Na het kweken wordt de vrije ruimte verzameld in een Tenax absorberende buis (Sigma-Aldrich, 28718-U SUPELCOTenax® TA / Carboxen® 1018) en geanalyseerd in GC-MS (gaschromatografie-massaspectrometrie). Een uniek vluchtig profiel van elke bacteriestam zal worden bepaald via een statistische analyse. Het volledige onderzoeksprotocol is beschikbaar in Addendum 1 hieronder.

Bij elke soort worden drie (3) herhalingen uitgevoerd.

Fase 2 - Karakterisering van vluchtige profielen voor veelvoorkomende orale aandoeningen en definiëren van gespecificeerde diagnostische nanoreceptoren De geteste monsters zijn van orale bacteriële plaque en geïnfecteerd dentine, gekweekt in verzegelde flessen, vergelijkbaar met fase 1.

De patiënten komen uit de studentenklinieken en de monsters worden genomen als onderdeel van hun tandheelkundige behandeling, namelijk: verwijdering van cariës en geïnfecteerd dentine voor toekomstig herstel, en tandsteen en tandplak verwijderen voor de behandeling van parodontitis.

1. Aan het begin van de behandelingssessie zal een geïnformeerde toestemming van de patiënt worden verkregen, waarmee wordt ingestemd met het gebruik van verwijderde plaque / geïnfecteerd dentine in onderzoek. Er wordt geen afwijking van het standaard behandelprotocol verwacht.

   1. Het plaquemonster van parodontale patiënten wordt genomen voordat de grove schaal is begonnen, met een handmatig hulpmiddel (Gracey 5-6 curette), uit het cervicale gebied van de onderkaaksnijtanden.
   2. Het geïnfecteerde dentinemonster van carieuze tanden wordt genomen met een handmatig gereedschap (lepelgraafmachine), nadat de oorspronkelijke vorm van de voorbereide holte is geschetst.
2. De verzamelde monsters worden vervolgens gekweekt in verzegelde flessen met Wilkins-Chalgren-medium, bij 37°C gedurende 48 uur, vergelijkbaar met stap 1 hierboven. Een fles met steriel medium wordt als controle gebruikt.
3. Headspace wordt vervolgens verzameld en geanalyseerd op dezelfde manier als de punten 5-8 in fase 1 hierboven.
4. Op dit punt wordt het unieke vluchtige profiel van elke patiënt gekoppeld aan zijn klinische diagnose (omvang van parodontitis/cariës) en geanalyseerd op statistische consistentie.
5. De gegevens die in de fasen 1-2 zijn verzameld, worden als geheel statistisch geanalyseerd.