Diagnose häufiger oraler Erkrankungen anhand flüchtiger Signaturprofile

Ärzte im antiken Griechenland wussten, dass das Riechen des Atems ihrer Patienten bei der Diagnose hilfreich sein kann. Doch während sich an dieser eher primitiven Diagnosemethode im Laufe der Jahrhunderte kaum etwas verändert hat, besteht in den letzten Jahren ein zunehmendes Interesse an der Verbesserung der Methoden der nichtinvasiven Frühdiagnose zahlreicher Stoffwechsel- und Infektionskrankheiten.

Derzeit werden viele Krankheiten aufgrund der verspäteten Diagnose übersehen und verschlimmert. In der Zahnmedizin meiden Patienten selbst für regelmäßige Kontrolluntersuchungen den Besuch beim Zahnarzt und erscheinen daher erst in einem späteren, fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung in der Klinik, leiden unter Schmerzen und Beschwerden, die leicht hätten verhindert werden können, und kommen erst in einem späten Stadium vor Krankheit und gefährden so das Behandlungsergebnis.

Aus diesem Grund besteht ein dringender Bedarf an einer kostengünstigen und minimalinvasiven Technologie, die als Diagnosehilfe dient und 1) eine effiziente Früherkennung und 2) eine individuelle Behandlung ermöglicht.

Diagnosemodalitäten, die auf dem Nachweis flüchtiger organischer Verbindungen (im Folgenden VOCs) basieren, d. h. organischer Verbindungen mit relativ hohem Dampfdruck bei Raumtemperatur, könnten die Antwort auf den oben genannten Bedarf sein.

„Elektronische Nasen“ zur Erkennung flüchtiger organischer Verbindungen in der ausgeatmeten Luft Krankheitsspezifische flüchtige organische Verbindungen entstehen hauptsächlich durch Veränderungen spezifischer biochemischer Wege im Körper. Nach ihrer Produktion durch menschliche oder bakterielle Zellen können VOCs unter anderem in Körperflüssigkeiten, einschließlich infizierter Zellen und/oder deren Mikroumgebung, Blut, Atem und Speichel, gefunden werden. Somit können VOCs, die von ihrem Ursprungsort freigesetzt werden, direkt im Blut und im Kopfraum von Zellen nachgewiesen werden.

Zahlreiche weltweite Forschungsgruppen untersuchen die Möglichkeit eines nicht-invasiven VOC-Nachweises in der ausgeatmeten Luft, der die Diagnose verschiedener systemischer Erkrankungen6 ermöglicht, darunter Karzinome (Lunge, Brust und Darm), Tuberkulose, Nierenversagen und Asthma. Bei den fraglichen VOCs handelt es sich um Alkane (C4-C20), Methylalkene und Benzolderivate, die bei gesunden Personen in Konzentrationen von 1–20 ppb (part per billion) vorkommen, während bei Krankheiten die Konzentration krankheitsspezifischer VOCs erhöht ist. Es wird vermutet, dass VOCs vom geschädigten Gewebe aufgrund von oxidativem Stress, von der Leber als Teil einer Stoffwechselreaktion oder vom Immunsystem produziert werden.

Eine „Elektronische Nase“ ist ein Gerät, das die flüchtige Zusammensetzung einer Luftprobe erkennen kann. Das Gerät besteht aus einer Reihe von Nanorezeptoren, die physikalische oder chemische Informationen in ein elektrisches Signal umwandeln können. Jeder Rezeptor im Array reagiert unterschiedlich auf die Materialien in der analysierten Probe, und die Kombination dieser Reaktionen mehrerer Rezeptoren erzeugt ein einzigartiges flüchtiges Profil, das sich durch Qualität (nämlich welche Moleküle sind in der Probe zu finden?) und Quantität (nämlich Wie hoch ist die genaue Konzentration jedes Moleküls?).

Ein elektronisches Nasensystem zur Luftprobenanalyse sollte normalerweise aus drei Schlüsselkomponenten bestehen:

1. Atem-/Headspace-Sammelgerät
2. Verarbeitungsgerät
3. Klassifizierungsalgorithmus. Die ersten und am weitesten verbreiteten Geräte dieser Art basieren auf der Analyse von Luftproben in einem Gaschromatographie-/Massenspektrometriesystem (GC-MS). Zu den fortschrittlichen Systemen gehören Methyloxid-Sensoren (MOS) oder Nanorezeptoren.

Ein auf Nanorezeptoren basierendes elektronisches Nasensystem (NaNose) wird im Labor des Co-PI (Prof. Haick, Fakultät für Chemieingenieurwesen, Technion, Haifa, Israel), der in der Lage ist, Spuren von VOCs in Konzentrationen von einzelnen Teilen pro Milliarde (1 µg/l) nachzuweisen. Gepaart mit einem computergestützten System, das in der Lage ist, große Datenmengen von Hunderten von Molekülen zu analysieren, die gleichzeitig von einer Reihe von 20 oder mehr Rezeptoren erfasst werden, übertrifft dieses System die anderen „elektronischen Nasen“-Geräte in Bezug auf Empfindlichkeit und Effizienz. Im Gegensatz zu teuren und langsamen GC-MS-Systemen sollte ein idealer auf Nanomaterialien basierender Sensor für Atemtests bei sehr geringen Konzentrationen flüchtiger organischer Verbindungen empfindlich sein, selbst wenn umweltbedingte oder physiologische Störfaktoren vorhanden sind. Es sollte außerdem schnell und proportional auf kleine Konzentrationsänderungen reagieren und eine konsistente Ausgabe liefern, die für eine bestimmte Verbindung spezifisch ist. Wenn der Sensor nicht mit den betreffenden Verbindungen in Kontakt kommt, sollte er schnell in seinen Ausgangszustand zurückkehren oder einfach und kostengünstig genug sein, um für den Einmalgebrauch geeignet zu sein.

Die Luftprobenahme mit solchen Rezeptoren sollte vergleichsweise einfach sein und ihre Ergebnisse können automatisch interpretiert werden, was sie für ein kostengünstiges Screening großer Populationen geeignet macht. Nur positiv getestete Patienten benötigen zur Bestätigung der Frühdiagnose eine herkömmliche und unangenehme Diagnostik, bevor eine Behandlung vorgeschlagen wird.

Dennoch neigen alle bestehenden VOC-basierten Diagnosemodalitäten dazu, zu vergessen, dass die ausgeatmete Luft eine Kombination aus zahlreichen Ursprüngen ist – der Lunge, dem oberen Gastrointestinaltrakt und der Mundhöhle mit einer kleinen nasalen Komponente. Während die Zusammensetzung und die Flüchtigkeitsprofile der Lungenluft in den letzten zehn Jahren gründlich erforscht wurden, um einen frühen diagnostischen Ansatz für Krebs zu finden10,15, blieb die orale Komponente weitgehend unberührt.

Mikronischen in der Mundhöhle gesunder Menschen beherbergen einen Biofilm, der über 1000 verschiedene Bakterienarten enthalten kann. Ohne aktive mechanische oder chemische Reinigung sammelt sich Biofilm an, verändert sich und reift, was zu einer Entzündung des Weichgewebes, einer sogenannten Gingivitis, führt. Bei einigen Personen und unter bestimmten Bedingungen schreitet die Entzündung zu einer Parodontitis fort und die Zusammensetzung des Biofilms verändert sich zu einem höheren Anteil anaerober gramnegativer Bakterien mit erhöhter Virulenz und Fähigkeit zum Gewebeaufbruch. Zusätzlich zu den Biofilm-Mikroorganismen können Serum, Zahnfleischexsudat, entzündetes Zahnfleischgewebe, Wunden und Läsionen, Pathologien im Zusammenhang mit Speicheldrüsen, Nebenhöhlen und der Nasenhöhle, Magen-Darm-Reflux, interdental eingeschlossene Speisereste und Umweltverschmutzung weitere VOC-Quellen in der Mundhöhle sein . Hertel et al. hat kürzlich über einzigartige flüchtige Profile im Kopfraum spezifischer oraler Bakterien und Pilze berichtet.

Wir gehen davon aus, dass Nanorezeptor-basierte Volatolomics als diagnostische Modalität für die nicht-invasive Frühdiagnose von Munderkrankungen auf der Grundlage einer Probe ausgeatmeter Luft eingesetzt werden können.

Ziel der vorgeschlagenen Forschung ist es, den Grundstein für eine schnelle, benutzerfreundliche und nicht-invasive Diagnosemethode für häufige orale Erkrankungen in ausgeatmeten Luftproben zu legen, die auf der NaNose basiert. Dies wird in absehbarer Zukunft als Grundlage für die Entwicklung eines marktfähigen klinischen oder häuslichen Diagnosegeräts dienen.

Konkrete Ziele:

1. Nachweis und Analyse von VOCs im Zusammenhang mit häufigen Munderkrankungen in den Kopfräumen von Mikroorganismenproben aus der Mundhöhle von Patienten mit diagnostizierter Gingivitis, Parodontalerkrankungen oder Karies und Vergleich mit einer Kontrollgruppe gesunder Patienten.
2. Charakterisierung flüchtiger Profile für häufige orale Erkrankungen und Definition spezifischer diagnostischer Nanorezeptoren.

Gewünschte Ergebnisse

1. Die Ergebnisse der vorgeschlagenen Forschung könnten zu einer Revolution bei Zahnärzten und der häuslichen Pflege führen. Bisher besteht die einzige Möglichkeit für eine Person, sich über ihre Munderkrankung zu informieren, darin, einen Termin beim Zahnarzt zu vereinbaren, doch ein erheblicher Teil der Bevölkerung vermeidet regelmäßige Kontrolluntersuchungen und Behandlungen. Ein einfaches Tool, das eine einfache und nicht-invasive Luftprobenahme zu Hause oder in einer Apotheke ermöglicht, wird die Compliance und Heilungsraten der Patienten deutlich erhöhen und die Gesundheitsausgaben senken.
2. Die VOC-Kartierung der Luft aus der Mundhöhle kann den diagnostischen Wert von Luftproben aus der Lunge erhöhen und so die Präzision, Sensitivität und Spezifität der nicht-invasiven Frühdiagnose von Krebs, Nierenversagen und anderen inneren Erkrankungen verbessern.

Methoden

Stufe 1 – Erkennung und Analyse von VOCs im Zusammenhang mit häufigen Munderkrankungen. Bekannte Bakterienstämme (Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Acinetobacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Lactobacillus acidophilus) werden separat in versiegelten Flaschen mit geeigneten Medien kultiviert, um dies zu ermöglichen Erfassung und Analyse des einzigartigen Luftraums im Inneren der Flaschen. Nach der Kultivierung wird der Headspace in einem Tenax-Absorptionsröhrchen (Sigma-Aldrich, 28718-U SUPELCOTenax® TA / Carboxen® 1018) gesammelt und in GC-MS (Gaschromatographie-Massenspektrometrie) analysiert. Über eine statistische Analyse wird ein einzigartiges Flüchtigkeitsprofil jedes Bakterienstamms ermittelt. Das vollständige Studienprotokoll finden Sie im Anhang 1 unten.

Bei jeder Belastung werden drei (3) Wiederholungen durchgeführt.

Stufe 2 – Charakterisierung flüchtiger Profile für häufige orale Erkrankungen und Definition spezifizierter diagnostischer Nanorezeptoren. Die getesteten Proben bestehen aus oralem bakteriellem Plaque und infiziertem Dentin, die ähnlich wie in Stufe 1 in versiegelten Flaschen kultiviert werden.

Die Patienten kommen aus den Kliniken der Studenten und die Proben werden im Rahmen ihrer zahnärztlichen Behandlung entnommen, und zwar zur Entfernung von Karies und infiziertem Dentin für zukünftige Restaurationen sowie zur Entfernung von Zahnstein und Plaque zur Behandlung von Parodontitis.

1. Zu Beginn der Behandlungssitzung wird vom Patienten eine Einverständniserklärung eingeholt, in der er der Verwendung der entfernten Plaque/des infizierten Dentins zu Forschungszwecken zustimmt. Es ist keine Abweichung vom Standardbehandlungsprotokoll zu erwarten.

   1. Die Plaque-Probe parodontaler Patienten wird vor Beginn der groben Zahnsteinentfernung mit einem manuellen Werkzeug (Gracey 5-6-Kürette) aus dem zervikalen Bereich der unteren Schneidezähne entnommen.
   2. Die infizierte Dentinprobe kariöser Zähne wird mit einem manuellen Werkzeug (Löffelbagger) entnommen, nachdem die ursprüngliche Form der vorbereiteten Kavität skizziert wurde.
2. Die gesammelten Proben werden dann in versiegelten Flaschen mit Wilkins-Chalgren-Medium bei 37 °C für 48 Stunden kultiviert, ähnlich wie in Stufe 1 oben. Als Kontrolle dient eine Flasche mit sterilem Medium.
3. Anschließend wird der Headspace gesammelt und analysiert, ähnlich wie bei den Punkten 5–8 in Stufe 1 oben.
4. Zu diesem Zeitpunkt wird das einzigartige volatile Profil jedes Patienten mit seiner klinischen Diagnose (Ausmaß der Parodontitis/Karies) verknüpft und auf statistische Konsistenz analysiert.
5. Die in den Stufen 1-2 gesammelten Daten werden als Ganzes statistisch analysiert.